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恒遠告訴大家：關(guān)于WB實驗的常見問題以及解決方案（3）
閱讀：2414 發(fā)布時間：2012-9-14
上海恒遠生物科技有限公司是一家生物技術(shù)企業(yè)，主要從事免疫學,、分子生物學和常規(guī)生化試劑的研發(fā),、銷售。并代理銷售Omega,、Sigma,、R&D、ATCC,、HYCLONE等二十多家國外,，致力于為廣大高校、科研院所和企事業(yè)單位提供*的科研試劑和完善的技術(shù)服務,，滿足生物化學,、分子生物學、細胞生物學,、免疫學等生物科技實驗需求,。
21、想分離的蛋白是分子量200kd的,，SDS-PAGE電泳的分離膠濃度多大合適,？積層膠的濃度又該用多少？這么大分子量的蛋白容易作Western Blot嗎,？
答：200kd的蛋白不好做,，分離膠用7％，積層膠 3.5％,。
22,、如果上樣量超載，要用什么方法來增加上樣量,？
答：可以濃縮樣品,，也可以根據(jù)你的目標分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地,，超載30％是不會有問題的,。如果已經(jīng)超了不少了，而且小分子量的也要,，可以考慮加大膠的厚度,，可以試試1.5mm的。
23,、蛋白變性后可以存放多久,？
答：－80℃,，一兩年沒有問題。zui關(guān)鍵兩條：不要被蛋白酶水解掉,；不要被細菌消化掉（也是被酶水解了）,。
24、我所測定的蛋白分子量是105KD,，按理說分離膠應當采用7.5%，但資料卻要求分離膠和濃縮膠均采用11％的配方,，不知為何,？
答：上述提到的兩種凝膠均可以使用，因為105KD的蛋白在上述兩種膠的線性分辨范圍內(nèi),，但需注意條帶位置,。
25、二抗是生物素化的抗體,，三抗是親和素生物素體系,，不知采用這樣的方案后，封閉液是否要作調(diào)整,，能否再用5％的脫脂奶粉呢,？好像有資料說脫脂奶粉會影響親和素生物素的，是嗎,？
解答：不能使用脫脂奶粉,，因為脫脂奶粉中含生物素，用ＢＳＡ代替應該好一點．
26,、問一般一次上樣的蛋白總量是多少,，跟目的蛋白的表達量有關(guān)系嗎？
答：Western Blot一般上樣30－100微克不等,，結(jié)果跟目的蛋白的豐度,、上樣量、一二抗的量和孵育時間都有關(guān)系,，也與顯色時間長短有關(guān),。開始摸條件時，為了拿到陽性結(jié)果,，各個步驟都可以量多一點時間長一點,，當然背景也就出來了。要拿到好的結(jié)果,，如果抗體好的話比較容易,，抗體不好的話就需要反復地試了，當然有的不適合Western Blot的怎樣做也不行,。
27,、做組織樣品的western的時候，怎樣處理樣品？
答：必須進行研磨,、勻漿,、超聲處理，蛋白質(zhì)溶解度會更好,，離心要充分,，膜蛋白需用更劇烈的方法抽提，低豐度膜蛋白可能還要分步抽提（超速離心）,。還有一點就是組織中的蛋白酶活性更強,，需要注意抑制蛋白酶的活性（加入ＰＭＳＦ）。
28,、問大分子量蛋白200KD,，在做western要注意什么呢？
答：做200kd蛋白的Western Blot時要注意,，分離膠選擇>7%的,；剝膠時要小心；轉(zhuǎn)移時間需要相應延長,；要做分子量參照（否則出現(xiàn)雜帶不知道如何分析）,。
29、有什么方法可以提高上樣量,？
答：a）可以濃縮樣品,；增大上樣體積來增大上樣量；b）用5倍的上樣緩沖液來稀釋變性
30,、蛋白的上樣量有沒有什么具體的要求,？
答：上樣量要根據(jù)實驗的要求來定，如果要求是定量和半定量的Western Blot 則上樣量要均等,，如果只是要定性,，則沒有太大的關(guān)系，盡量多上就行了,，但是不要超載,。
答：200kd的蛋白不好做,，分離膠用7％，積層膠 3.5％,。
22,、如果上樣量超載，要用什么方法來增加上樣量,？
答：可以濃縮樣品,，也可以根據(jù)你的目標分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地,，超載30％是不會有問題的,。如果已經(jīng)超了不少了，而且小分子量的也要,，可以考慮加大膠的厚度,，可以試試1.5mm的。
23,、蛋白變性后可以存放多久,？
答：－80℃,，一兩年沒有問題。zui關(guān)鍵兩條：不要被蛋白酶水解掉,；不要被細菌消化掉（也是被酶水解了）,。
24、我所測定的蛋白分子量是105KD,，按理說分離膠應當采用7.5%，但資料卻要求分離膠和濃縮膠均采用11％的配方,，不知為何,？
答：上述提到的兩種凝膠均可以使用，因為105KD的蛋白在上述兩種膠的線性分辨范圍內(nèi),，但需注意條帶位置,。
25、二抗是生物素化的抗體,，三抗是親和素生物素體系,，不知采用這樣的方案后，封閉液是否要作調(diào)整,，能否再用5％的脫脂奶粉呢,？好像有資料說脫脂奶粉會影響親和素生物素的，是嗎,？
解答：不能使用脫脂奶粉,，因為脫脂奶粉中含生物素，用ＢＳＡ代替應該好一點．
26,、問一般一次上樣的蛋白總量是多少,，跟目的蛋白的表達量有關(guān)系嗎？
答：Western Blot一般上樣30－100微克不等,，結(jié)果跟目的蛋白的豐度,、上樣量、一二抗的量和孵育時間都有關(guān)系,，也與顯色時間長短有關(guān),。開始摸條件時，為了拿到陽性結(jié)果,，各個步驟都可以量多一點時間長一點,，當然背景也就出來了。要拿到好的結(jié)果,，如果抗體好的話比較容易,，抗體不好的話就需要反復地試了，當然有的不適合Western Blot的怎樣做也不行,。
27,、做組織樣品的western的時候，怎樣處理樣品？
答：必須進行研磨,、勻漿,、超聲處理，蛋白質(zhì)溶解度會更好,，離心要充分,，膜蛋白需用更劇烈的方法抽提，低豐度膜蛋白可能還要分步抽提（超速離心）,。還有一點就是組織中的蛋白酶活性更強,，需要注意抑制蛋白酶的活性（加入ＰＭＳＦ）。
28,、問大分子量蛋白200KD,，在做western要注意什么呢？
答：做200kd蛋白的Western Blot時要注意,，分離膠選擇>7%的,；剝膠時要小心；轉(zhuǎn)移時間需要相應延長,；要做分子量參照（否則出現(xiàn)雜帶不知道如何分析）,。
29、有什么方法可以提高上樣量,？
答：a）可以濃縮樣品,；增大上樣體積來增大上樣量；b）用5倍的上樣緩沖液來稀釋變性
30,、蛋白的上樣量有沒有什么具體的要求,？
答：上樣量要根據(jù)實驗的要求來定，如果要求是定量和半定量的Western Blot 則上樣量要均等,，如果只是要定性,，則沒有太大的關(guān)系，盡量多上就行了,，但是不要超載,。
如果你想了解更多關(guān)于western blot的信息，來函,！