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恒遠告訴大家：WB實驗的常見問題答疑（1）
閱讀：2424 發(fā)布時間：2012-7-25
恒遠告訴大家：關(guān)于WB實驗的常見問題以及解決方案（1）
上海恒遠生物科技有限公司是一家生物技術(shù)企業(yè),，主要從事免疫學(xué)、分子生物學(xué)和常規(guī)生化試劑的研發(fā),、銷售,。并代理銷售Omega、Sigma,、R&D,、ATCC、HYCLONE等二十多家國外,，致力于為廣大高校,、科研院所和企事業(yè)單位提供*的科研試劑和完善的技術(shù)服務(wù)，滿足生物化學(xué),、分子生物學(xué),、細胞生物學(xué)、免疫學(xué)等生物科技實驗需求,。
1,、western blot 的優(yōu)點
答：靈敏，可達ng級，用Ecl顯色法理論上可達pg 級,。方便,，特異性高。
2,、為什么我的細胞提取液中沒有目標蛋白,？
答：原因有很多: a） 你的細胞中不表達這種蛋白質(zhì)，換一種細胞,；b） 你的細胞中的蛋白質(zhì)被降解掉了,，你必需加入PMSF，抑制蛋白酶活性,；c） 你的抗體不能識別目標蛋白,，多看看說明，看是否有問題,。
3,、我的細胞提取液有的有沉淀，有的很清亮,，為什么呢,？
答： a） 有沉淀可能因為你的蛋白沒有變性*，可以適當提高SDS 濃度,，同時將樣品煮沸時間延長,， b） 也不排除你的抗原濃度過高，這時再加入適量上樣緩沖液即可,。
4,、我做的蛋白質(zhì)分子量很小（10KD）,，請問怎么做WB,？
答：可以選擇0.2μml的膜，同時縮短轉(zhuǎn)移時間,。也可以將兩張膜疊在一起,，再轉(zhuǎn)移。其他按步驟即可,。
5,、我的目的帶很弱，怎么加強,？
答：可以加大抗原上樣量,。這是zui主要的。同時也可以將一抗稀釋比例降低,。
6,、膠片背景很臟,，有什么解決方法？
答：減少抗原上樣量,，降低一抗?jié)舛?，改變一抗孵育時間，提高牛奶濃度,。
7,、目標帶是空白，周圍有背景,，是為什么,？
答：你的一抗?jié)舛容^高，二抗上HRP 催化活力太強,，同時你的顯色底物處于一個臨界點,，反應(yīng)時間不長，將周圍底物催化完,，形成了空白即“反亮現(xiàn)象”,。將一抗和二抗?jié)舛冉档?，或更換新底物,。
8、我的膠片是一片空白,，是怎么回事,？
答：如果能夠排除下面的幾個問題那么問題多半出現(xiàn)在一抗和抗原制備上。
a） 二抗的HRP 活性太強,，將底物消耗光,；b） ECM底物中H2O2，不穩(wěn)定,，失活,；c） ECL底物沒覆蓋到相應(yīng)位置；d） 二抗失活,。
答：靈敏，可達ng級，用Ecl顯色法理論上可達pg 級,。方便,，特異性高。
2,、為什么我的細胞提取液中沒有目標蛋白,？
答：原因有很多: a） 你的細胞中不表達這種蛋白質(zhì)，換一種細胞,；b） 你的細胞中的蛋白質(zhì)被降解掉了,，你必需加入PMSF，抑制蛋白酶活性,；c） 你的抗體不能識別目標蛋白,，多看看說明，看是否有問題,。
3,、我的細胞提取液有的有沉淀，有的很清亮,，為什么呢,？
答： a） 有沉淀可能因為你的蛋白沒有變性*，可以適當提高SDS 濃度,，同時將樣品煮沸時間延長,， b） 也不排除你的抗原濃度過高，這時再加入適量上樣緩沖液即可,。
4,、我做的蛋白質(zhì)分子量很小（10KD）,，請問怎么做WB,？
答：可以選擇0.2μml的膜，同時縮短轉(zhuǎn)移時間,。也可以將兩張膜疊在一起,，再轉(zhuǎn)移。其他按步驟即可,。
5,、我的目的帶很弱，怎么加強,？
答：可以加大抗原上樣量,。這是zui主要的。同時也可以將一抗稀釋比例降低,。
6,、膠片背景很臟,，有什么解決方法？
答：減少抗原上樣量,，降低一抗?jié)舛?，改變一抗孵育時間，提高牛奶濃度,。
7,、目標帶是空白，周圍有背景,，是為什么,？
答：你的一抗?jié)舛容^高，二抗上HRP 催化活力太強,，同時你的顯色底物處于一個臨界點,，反應(yīng)時間不長，將周圍底物催化完,，形成了空白即“反亮現(xiàn)象”,。將一抗和二抗?jié)舛冉档?，或更換新底物,。
8、我的膠片是一片空白,，是怎么回事,？
答：如果能夠排除下面的幾個問題那么問題多半出現(xiàn)在一抗和抗原制備上。
a） 二抗的HRP 活性太強,，將底物消耗光,；b） ECM底物中H2O2，不穩(wěn)定,，失活,；c） ECL底物沒覆蓋到相應(yīng)位置；d） 二抗失活,。
9,、我在顯影液中顯影1分鐘和5分鐘后,底片漆黑一片,是什么原因呢?
答：a） 可能是紅燈造成的, 膠片本來就被曝光了，可以在*黑暗的情況下操作.看是否有改善.,；b） 顯影時間過長,。
答：a） 可能是紅燈造成的, 膠片本來就被曝光了，可以在*黑暗的情況下操作.看是否有改善.,；b） 顯影時間過長,。
10、DAB好還是ECM好,？
答：DAB 有毒,，但是比較靈敏，是HRP zui敏感的底物,；ECM結(jié)果容易控制,，但被催化時靈敏度差一點,，但如果達到閥值，就特別靈敏,，可以檢測pg 級抗原,。要看你實驗的情況
答：DAB 有毒,，但是比較靈敏，是HRP zui敏感的底物,；ECM結(jié)果容易控制,，但被催化時靈敏度差一點,，但如果達到閥值，就特別靈敏,，可以檢測pg 級抗原,。要看你實驗的情況
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