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酶聯(lián)免疫吸附試驗C1q測定法
閱讀：664 發(fā)布時間：2011-10-24
1 原理包被于塑料板上的固相凝聚IgG與酶聯(lián)C1q的結(jié)合受標(biāo)本中免疫復(fù)合物的抑制，是一種競爭性抑制試驗,。為避免標(biāo)本中內(nèi)源C1q的干擾,，應(yīng)預(yù)先用IgG免疫吸附劑將其除去。
2 材料
（1） 聚苯乙烯反應(yīng)板,，酶聯(lián)免疫檢測儀,。
（2） 免疫吸附劑系結(jié)合有IgG的纖維素。取纖維素（5%,，pH值105）與溴化*一起室溫反應(yīng)10min,，用01mol/L碳酸氫鈉緩沖液（pH值80）充分洗滌。再與IgG一起于4℃下作用18h（20ml緩沖液中含3g纖維素和100mg IgG）,。制備物用27mol/L甘氨酸緩沖液（pH值80）配成20%（W/V）懸液,，貯于4℃。
（3） 酶聯(lián)C1q用戊二醛法將辣根過氧化物酶標(biāo)記C1q,，再經(jīng)超濾AmiconXM200濾膜）分離貯于－20℃,。
（4） 其他試劑002mol/L TrisHCl緩沖液（pH值90）；02mol/L TrisHCl緩沖液（pH
值7.4）,，以及含005%Tween20的同一緩沖液,；02mol/L EDTA （pH值76）；酶底物溶液和中止液,。
3 方法
（1） 包被凝聚IgG取經(jīng)002mol/L TrisHCl緩沖液（pH值90）透析過夜的凝聚IgG（100μg/ml）,，加入聚苯乙烯板孔內(nèi)，每孔100μl,，37℃包被30min后,，用緩沖液洗3次（第1次、第3次用02mol/L TrisHCl緩沖液（pH值74）,；第2次用含005% Tween20的同一緩沖液） ,真空干燥,，貯于4℃。
（2） 取血清標(biāo)本50μl,，加入02mol/L EDTA（pH值76）50μl,，室溫作用10min，使內(nèi)源C1 q游離,，然后加入IgG免疫吸附劑500μl,，室溫振蕩20min，再以500r/min離心5min,，得到1∶10稀釋的上清液,。
（3） 取已包被凝聚IgG的塑料反應(yīng)板，每孔中加入上述上清液90μl,，酶聯(lián)C1q10μl（1∶100 ～200稀釋液）,，室溫下反應(yīng)20min，然后用含02mol/L NaCl,，005%Tween20的02mol/L TrisHCl緩沖液（pH值74）洗3次,，再加入100μl底物溶液（pH值60、01mol/L磷酸鹽枸櫞酸鹽緩沖液50ml中,，加入鄰苯二胺20mg,，30%（W/V）過氧化氫10μl），室溫放30min,，加入2mol/L硫酸50μl中止反應(yīng),，于492nm讀取吸光值。如果定量,，可用凝聚IgG制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,，測出免疫復(fù)合物的相對含量。
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