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恒遠產品文獻:星形膠質細胞在降鈣素中樞鎮(zhèn)痛 機制中的作用 *
閱讀：495 發(fā)布時間：2019-11-22星形膠質細胞在降鈣素中樞鎮(zhèn)痛機制中的作用 *
李海英 1 △ 肖 智 2 △ 李樹法 3向 菲 4 王 青 1
（1 貴陽市第yi人民醫(yī)院內分泌科,，貴陽 550002,；2 遵義醫(yī)學院醫(yī)學與生物學研究中心,，遵義 563003；3 臨沂市人民醫(yī)院內分泌科,，臨沂 276000,；4 貴陽市第二人民醫(yī)院內分泌科，貴陽 550081）
摘 要 目的：觀察降鈣素（sCT）對神經病理性疼痛大鼠中腦導水管周圍灰質（PAG）星形膠質細胞 D-絲氨酸（D-Ser）釋放的影響,，明確星形膠質細胞在 sCT 鎮(zhèn)痛中作用機制,。方法：72 只雄性 SD 大鼠建立坐骨神經結扎神經病理性疼痛大鼠模型后，隨機分為 6 組 (n = 12)：正常組,、CCI 組,、sCT 組、射氟代檸檬酸 (FCA) 組,、苯甲酸鈉 (SB) 組和 7- 氯犬尿酸 (CK) 組,。除正常組及 CCI 組外大鼠均腹腔內 sCT。von Frey 纖維檢測其機械痛閾值 (MWT),，ELISA 法檢測其 PAG 中 D-Ser 水平,。結果：建模后大鼠 MWT 下降，給予腹腔注射 sCT 后,，D-Ser 水平和 MWT 顯著上升（P 均 < 0.001）,；PAG 注射 FCA 或 SB，分別引起 sCT 治療大鼠 D-Ser 水平和 MWT 下降或上升（P 均 < 0.001）,；PAG 注射CK 引起 sCT 治療大鼠 MWT 下降（P < 0.001）,，D-Ser 水平無變化。結論：sCT 引起神經病理性疼痛大鼠 PAG 星形膠質細胞活化,，D-Ser 釋放增加,，增強 NMDA 受體功能產生鎮(zhèn)痛作用。
關鍵詞 降鈣素,；星形膠質細胞,；D- 絲氨酸；中腦導水管周圍灰質,；神經病理性疼痛既往認為,，哺乳動物體內無D-絲氨酸（D-serine，D-Ser）存在,。隨后研究發(fā)現哺乳動物（大鼠）大腦星形膠質細胞中有 D-Ser 和 D-Ser 消旋酶（serine racemase，SR）存在,，且活化的星形膠質細胞可釋放 D-Ser,，近年發(fā)現除了星形膠質細胞（主要）,，神經元也可以釋放 D-Ser[1]。合成和降解 D-Ser 的酶分別是 SR 和 D- 氨基酸氧化酶 (D-amino acid oxidase,，DAAO),。D-serine 可以作為共激動劑 (co-agonist)，與 N- 甲基 -D- 門冬氨酸受體（N-methyl-D-aspartate,，NMDA）的 NR1 亞基的“甘氨酸位點”進行結合,，是調節(jié) NMDA 受體活性及神經毒性的關鍵因子，因此膠質細胞通過突觸小泡形式釋放 D-Ser 與 NMDA受體作用實現對神經元功能的調節(jié) [2],。中腦導水管周圍灰質（periaqueductal gray,，PAG）接受來自外周的疼痛信息，同時也接受高位中樞的疼痛調制信息,，是機體內源性鎮(zhèn)痛系統(tǒng)的關鍵結構,，近年發(fā)現，PAG 也是機體下行性疼痛易化系統(tǒng)的關鍵結構,。興奮性神經遞質谷氨酸 (glutamate, Glu) 及其受體在疼痛調制中作用重大,。脊髓和外周，Glu 水平的提高和 / 或 NMDA 受體的活化可產生致痛作用,，而在脊髓上結構,，Glu 水平的提高和 / 或NMDA 受體的活化可產生鎮(zhèn)痛作用。研究證實：大鼠 PAG 中微量注射 NMDA 產生強大的鎮(zhèn)痛作用,，而 NMDA 受體拮抗劑 D-AP7 可減弱此鎮(zhèn)痛作用,，說明 PAG 中 NMDA 受體的活化將產生鎮(zhèn)痛作用 [3]。如前所述,，D-Ser 是 NMDA 受體甘氨酸位點的激動劑,，其激動作用強于 Gly。Martins 研究發(fā)現 [4]：PAG 微量注射 Gly 可劑量依賴的提高大鼠甩尾反射閾值,，產生鎮(zhèn)痛作用,，那么很有可能 PAG 中 D-ser的增多也可以產生鎮(zhèn)痛作用。結合前期研究 [5]：對慢性神經病理性疼痛（CCI 模型）大鼠 PAG 微量注射鮭魚降鈣素 (salmon calcitonin,，sCT) 后,，CCI 大鼠疼痛行為緩解，機械痛閾 (mechanical withdrawal thresholds,，MWT) 和熱痛閾上調,，那么 sCT 在 PAG的鎮(zhèn)痛機制是否也包含 D-Ser 的介入呢？本研究將通過腹腔注射 sCT 后,，觀察 PAG 中 D-Ser 水平變化以及其變化對 sCT 鎮(zhèn)痛作用的影響,。
方 法
1. 材料
（1）動物：雄性清潔級 SD 大鼠 72 只，體質量 210 ～ 220 g,，由遵義醫(yī)學院實驗動物中心提供,，合格證號：SYXK（黔）2011-003,。在安靜、溫度 24±2℃,、濕度 60%±5%,、明暗各 12 h (8AM-8PM) 周期環(huán)境中飼養(yǎng)，每籠 4 ～ 5 只,。大鼠自由飲食和飲水,。隨機分為正常組、CCI 組,、sCT 組,、氟 代 檸 檬 酸 (fluorocitrate, FCA) 組、7- 氯 犬 尿 酸(7-chlorokynurenate,，CK) 組,、 苯 甲 酸 鈉 (sodium benzoate，SB) 組,，每組 12 只,。建模后 14 d，每組大鼠各隨機取 6 只,，ELISA 法檢測 PAG 中 D-Ser 水平,，余下 6 只繼續(xù)觀察機械痛閾變化，直到建模后21 d,。sCT 組大鼠從 CCI 手術后 1 d 開始,，每日給予 sCT（2 µg/(kg.d)，i.p.）,，直到手術后 21 d 實驗結束,。FCA 組、7-CK 組和苯甲酸鈉組取 CCI 建模并經 sCT 腹腔注射 14 d 大鼠,，分別在大鼠 PAG 微量 注 射 FCA (1.2 µg/0.3 µl),、SB (150 µg/0.3 µL) 和7-CK (3.6 µg/0.3 µL)，觀察大鼠機械痛閾以及 D-Ser水平變化,。本實驗嚴格按照疼痛學會 (IASP) 關于應用動物進行疼痛研究的倫理綱要進行操作,。
（2） 試 劑：sCT（ 美 國 Sigma 公 司）， 溶 于0.001N 醋酸 , 終濃度 1 µg/ml,； FCA（美國 Sigma公司）, 溶于生理鹽水,，終濃度 4 mg/ml；SB（美國Sigma 公司）溶于生理鹽水,，終濃度 500 mg/ml,；7-CK（美國 Sigma 公司）溶于含 5% 二甲基亞砜（DMSO）的 PBS 溶液，終濃度 12mg/ml；腦立體定位儀（日本 Narishige 公司）,；微量進樣器 (5 µl,，寧波鎮(zhèn)海玻璃儀器廠 ),；D-serine 酶聯免疫分析試劑盒（上海恒遠生物科技有限公司）,；酶標儀（芬蘭，Labsystems Multiskan MS 352 型）,；洗板機（芬蘭Thermo Labsystems,，AC8 型）； 電 子 Von Frey 測痛儀（2390 系列,，美國 IITC Life Science）
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