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上海恒遠(yuǎn)技術(shù)重點(diǎn)講談ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方案
閱讀：1397 發(fā)布時(shí)間：2016-4-26 我公司成立至今七年之久，在前面的內(nèi)容中我司為大家介紹了許多相關(guān)操作方法,、操作技巧,、經(jīng)驗(yàn)總結(jié)等，有愈多用戶反應(yīng)從中學(xué)到了不少知識(shí),。在今天的內(nèi)容中,，上海恒遠(yuǎn)生物為大家重點(diǎn)講談ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方案。
一,、雙抗體夾心法
1.測(cè)抗原
① 將特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié),，形成固相抗體。洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。
② 加受檢標(biāo)本,，保溫反應(yīng),。標(biāo)本中的抗原與固相抗體結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物,。洗滌除去其他未結(jié)合物質(zhì),。
③ 加酶標(biāo)抗體，保溫反應(yīng),。固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合,。*洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。此時(shí)固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢抗原的量相關(guān),。
④ 加底物顯色,。固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。
2.測(cè)抗體
反應(yīng)模式與雙抗體夾心法類似,。用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物,，以檢測(cè)相應(yīng)的抗體。與間接法測(cè)抗體的不同之處為以酶標(biāo)抗原代替酶標(biāo)抗抗體,。此法中受檢標(biāo)本不需稀釋，可直接用于測(cè)定,，因此其敏感度相對(duì)高于間接法,。乙肝標(biāo)志物中抗HBs的檢測(cè)常采用本法。本法關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備,，應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同,，尋找合適的標(biāo)記方法。
二,、間接法測(cè)抗體
原理：為利用酶標(biāo)記的抗抗體(抗人免疫球蛋白抗體)以檢測(cè)與固相抗原結(jié)合的受檢抗體,，故稱為間接法。
操作步驟：
1.將特異性抗原與固相載體聯(lián)結(jié),，形成固相抗原,。洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。
2.加稀釋的受檢血清,，保溫反應(yīng),。血清中的特異抗體與固相抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物,。經(jīng)洗滌后,，固相載體上只留下特異性抗體，血清中的其他成份在洗滌過(guò)程中被洗去,。
3.加酶標(biāo)抗抗體,，可用酶標(biāo)抗人Ig以檢測(cè)總抗體，但一般多用酶標(biāo)抗人IgG檢測(cè)IgG抗體,。固相免疫復(fù)合物中的抗體與酶標(biāo)抗體抗體結(jié)合,，從而間接地標(biāo)記上酶,。洗滌后，固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢抗體的量正相關(guān),。
4.加底物顯色本法主要用于對(duì)病原體抗體的檢測(cè)而進(jìn)行傳染病的診斷,。
優(yōu)點(diǎn)評(píng)估：只要變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗抗體建立檢測(cè)相應(yīng)抗體的方法。間接法成功的關(guān)鍵在于抗原的純度,。雖然有時(shí)用粗提抗原包被也能取得實(shí)際有效的結(jié)果,，但應(yīng)盡可能予以純化，以提高試驗(yàn)的特異性,。
三,、競(jìng)爭(zhēng)法
1.測(cè)抗體
當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時(shí),，可用此法檢測(cè)特異性抗體,。其原理為標(biāo)本中的抗體和一定量的酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)與固相抗原結(jié)合。標(biāo)本中抗體量越多,，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗體愈少,，因此陽(yáng)性反應(yīng)呈色淺于陰性反應(yīng)。
如抗原為高純度的,，可直接包被固相,。如抗原中會(huì)有干擾物質(zhì)，直接包被不易成功,，可采用捕獲包被法,，即先包被與固相抗原相應(yīng)的抗體，然后加入抗原,，形成固相抗原,。洗滌除去抗原中的雜質(zhì)，然后再加標(biāo)本和酶標(biāo)抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng),。競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體有多種模式,，可將標(biāo)本和酶標(biāo)抗體與固相抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，抗HBc ELISA一般采用此法,。另一種模式為將標(biāo)本與抗原一起加入到固相抗體中進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合,，洗滌后再加入酶標(biāo)抗體，與結(jié)合在固相上的抗原反應(yīng),?？笻Be的檢測(cè)一般采用此法。
2.競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原
小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個(gè)以上的位點(diǎn),，因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測(cè)定,，可以采用競(jìng)爭(zhēng)法模式。其原理是標(biāo)本中的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合。標(biāo)本中抗原量含量愈多,，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原愈少,，zui后的顯色也愈淺。 
四,、捕獲包被法測(cè)抗體
如用抗原包被的間接法直接測(cè)定IgM抗體,，因標(biāo)本中一般同時(shí)存在較高濃度的IgG抗體，后者將競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合固相抗原而使一部份IgM抗體不能結(jié)合到固相上,。因此如用抗人IgM作為二抗,，間接測(cè)定IgM抗體，必須先將標(biāo)本用A蛋白或抗IgG抗體處理,，以除去IgG的干擾,。
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