化工儀器網(wǎng)
技術文章
上海恒遠為您講解：PCR過程Z常見的三種檢測模式
閱讀：1581 發(fā)布時間：2014-8-14定量PCR（Polymerase Chain Reaction）技術有廣義概念和狹義概念,。廣義概念的定量PCR技術是指以外參或內參為標準,，通過對PCR終產(chǎn)物的分析或PCR過程的監(jiān)測,，進行PCR起始模板量的定量。狹義概念的定量PCR技術（嚴格意義的定量PCR技術）是指用外標法（熒光雜交探針保證特異性）通過監(jiān)測PCR過程（監(jiān)測擴增效率）達到定量起始模板數(shù)的目的,，同時以內對照有效排除假陰性結果（擴增效率為零）,。
PCR過程的監(jiān)測有多種檢測模式。zui常用的有三種檢測模式：
⑴SYBR Green I 檢測模式,。溫度循環(huán)為94—55—72°C三步法,，只有引物，無探針,，熒光染料鑲嵌在雙股螺旋鏈中間,。通過對特定方向的強熒光檢測獲得信號，這種試劑檢測模式易產(chǎn)生非特異信號,，且本底光較大,。
⑵水解探針模式（Taqman）Hydrolysis Probe。溫度循環(huán)為94—60°C二步法,，不僅有引物,，還有另外一個特異針對擴增模板的探針在引物對之間。在探針相鄰兩個堿基上分別結合兩個熒光染料,，一個染料接受激發(fā)光得到的能量傳給了第二個染料,，接受能量的第二個染料通過發(fā)射特征光子回到穩(wěn)定態(tài)。當Taq酶在60°C延伸擴增鏈時,，遇到探針,，利用Taq酶5`—3`外切酶活性將探針水解成單個堿基，單個堿基之間距離較遠,，*個染料的能量無法傳給第二個染料,，只好通過發(fā)射特征光子回到穩(wěn)定態(tài)，通過對溶液中*個染料的熒光檢測獲得信號,。這種試劑檢測模式增加了檢測信號的特異性,，但是由于利用了Taq酶5`—3`外切酶活性，一般試劑廠家只給Taq酶的聚合酶活性定標,，沒有同時給Taq酶5`—3`外切酶活性定標,，不同批號試劑之間會給定量帶來差異。另外對探針的熔點溫度（Tm）僅要求其高于60°C,，這就使不同試劑盒之間的特異性參差不齊,，而且無法做質控檢測。
⑶雜交探針（Hybridization Probes）模式,。溫度循環(huán)為94—55—72°C三步法,，有引物，二個特異針對擴增模板相鄰的探針在引物對之間，在一個探針3`堿基上結合一個熒光染料,，在另一個探針5`堿基上結合第二個熒光染料,。在55°C時，兩個探針都剛好接合在模板上,，*個染料接受激發(fā)光得到的能量傳給了第二個染料,，接受能量的第二個染料通過發(fā)射特征光子回到穩(wěn)定態(tài)，通過對結合在擴增模板上雙探針中第二個染料的熒光檢測獲得信號,。這種試劑檢測模式中熒光信號與特定雜交溫度相關,，探針的濃度始終保持不變，因此可以在擴增后檢測熔解曲線作為信號的特異性質控,。另外這種試劑檢測模式可以用于點突變檢測,。