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核酸分離與純化的原則
閱讀：1218 發(fā)布時(shí)間：2014-3-21材料與方法的選擇
(一)材料與方法的選擇
臨床常見的標(biāo)本有血液,，尿液,，唾液，組織及培養(yǎng)細(xì)胞等,；核酸分離與純化的方法非常多,，如何恰當(dāng)?shù)厥占c準(zhǔn)備材料，選擇適宜的分離與純化方法是一個(gè)首要的問題,。首先我們應(yīng)當(dāng)明確核酸的分離與純化并不是zui終的目的,，不同的實(shí)驗(yàn)研究與應(yīng)用對核酸的產(chǎn)量，完整性,，純度和濃度可能有不同的要求,；至于分離與純化核酸所需的時(shí)間與成本也往往需要考慮；在不影響核酸質(zhì)量的情況下,，應(yīng)選擇安全無毒的試劑與方案,。近年來，有關(guān)試劑盒的開發(fā)與自動(dòng)化儀器的使用，能批量制備核酸樣品,，大大提高了分離與純化的效率,。
(二)選擇的原則
核酸分離與純化的方法很多，應(yīng)根據(jù)具體生物材料的性質(zhì)與起始量,，待分離核酸的性質(zhì)與用途而采取不同的方案,。無論采取何種方法，都應(yīng)遵循總的原則:一是保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性,，因?yàn)橥暾囊患壗Y(jié)構(gòu)是核酸結(jié)構(gòu)和功能研究的zui基本的要求,；二是盡量排除其它分子的污染，保證核酸樣品的純度,，這是本章討論的主要內(nèi)容,。
(三)核酸完整性的保持
為了保證核酸的完整性，在操作過程中,，首先應(yīng)盡量避免各種有害因素對核酸的破壞,。影響核酸完整性的因素很多，包括物理,，化學(xué)與生物學(xué)的因素,，其中有些是可以避免的。如過酸或過堿,，對核酸鏈中的磷酸二酯鍵有破壞作用,，在核酸的提取過程中，采用適宜的緩沖液,，始終控制pH在4～10之間,，就可以很好地避免其危害；另外如高溫加熱,，除高溫本身對核酸分子中的化學(xué)鍵的破壞作用外,，還可能因煮沸帶來液體剪切力，因此核酸提取常常在0～4℃的條件下進(jìn)行,。
其次對無法避免的有害因素,，應(yīng)采取多種措施，盡量減輕各種有害因素對核酸的破壞,。應(yīng)盡量簡化分離純化的步驟,，縮短提取的時(shí)間，減輕各種有害因素對核酸完整性的破壞,；DNA酶(DNase或DNAase)的激活需要Mg2+,，Ca2+等二價(jià)金屬離子，若使用EDTA,，檸檬酸鹽并在低溫條件下操作,，基本上就可以抑制DNA酶的活性,。RNA酶(RNase或RNAase)的廣泛存在與不易失活的特點(diǎn)，決定了生物降解是RNA提取過程中的主要危害因素,。