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探討兩種方法檢測HBsAg假陽性和假陰性的影響因素
閱讀：973 發(fā)布時間：2023-12-26 為了減少HBsAg檢測出現(xiàn)假陽性和假陰性,，我們有必要對這種現(xiàn)象的原因進行分析,，在實際的檢測工作中,，造成HBsAg檢測出現(xiàn)假陽性和假陰性主要受以下因素影響，分述如下：
1,、ELISA法假陰性原因
1.1 標本用肝素或EDTA等抗凝處理易造成HBsAg檢測結(jié)果假陰性,，肝素抗凝血漿會增加OD值,可能與高濃度肝素具有強大的負電荷,能吸附酶標記物不易洗脫有關(guān),；EDTA,、酶抑制劑（如NaN3）可抑制ELISA系統(tǒng)中的辣根過氧化物酶活性，造成假陰性,。
1.2 標本保存不當,在冰箱內(nèi)保存過久的標本,血清中IgG可聚合成多聚體,、AFP可形成二聚體,。標本放置時間延長（如一天以上），有時抗原或抗體免疫活性減弱,，便出現(xiàn)假陰性,。因此若采血后不能及時檢測，5天內(nèi)檢測標本分離血清置于4,。C冰箱內(nèi),；超過5天不能檢測的，應(yīng)放在-20,。C低溫冰箱中,。
1.3 低濃度HBsAg標本（弱陽性HBsAg）易受加樣時間（特別是大批量標本）、試劑平衡時間,、溶血程度的影響,，出現(xiàn)假陰性。如加樣時間在30分鐘內(nèi)的差異是zui大的,。
1.4 高濃度HBsAg在ELISA一步法檢測中易出現(xiàn)假陰性,，即HBsAg的鉤狀效應(yīng)。從原理來講,，一步法中HBsAg與包被板上的HBsAb及酶結(jié)合的HBsAb結(jié)合是雙向的,，當HBsAg濃度過高時，HBsAg與包被板上的抗體及酶結(jié)合物中的抗體均是單向結(jié)合,，不能形成抗體－抗原－抗體酶復(fù)合物,，使酶標記抗體在隨后的洗板中洗掉，從而顯出陰性結(jié)果,。但是在ELISA兩步法中,，高濃度的HBsAg只能與包被的HBsAb“飽和"地結(jié)合，多余部分被洗掉,，隨后加入的酶結(jié)合的HBsAb正好通過HBsAg的“橋梁"作用而結(jié)合在酶標板上,，顯示陽性結(jié)果。因此當HBsAg強濃度時用ELISA一步法檢測存在假陰性現(xiàn)象,。解決此問題的zui hao辦法有：對標本進行稀釋,；不單檢測HBsAg；采用ELISA兩步法檢測可消除漏檢現(xiàn)象,。
1.5 由于慢性病毒攜帶者(低水平HBsAg攜帶者)或HBV感染的潛伏期,HBsAg濃度低于檢測水平的下限,，由此造成假陰性。
1.6 S基因突變導(dǎo)致HBsAg的氨基酸結(jié)構(gòu)改變,，由于多數(shù)商用試劑盒檢測系統(tǒng)采用的為多克隆抗體檢測HBsAg的a決定簇,，這一區(qū)域的點突變即可導(dǎo)致臨界觀測值或陰性結(jié)果，造成假陰性,。
2,、ELISA法假陽性原因
2.1溶血或紅細胞：有國內(nèi)報道酶免HBsAg試劑檢測溶血標本時可造成假陽性,，因紅細胞破壞溶解時釋放出大量血紅蛋白，血紅蛋白的亞鐵血紅素具有弱過氧化物酶活性,，其作用效應(yīng)與辣根過氧化物酶（HRP）類似,，能與預(yù)包被抗體（Ab）結(jié)合，一步法洗脫步驟往往難以wan全洗脫,，殘留的過氧化物酶催化底物四甲基聯(lián)苯胺（TMB）產(chǎn)生假陽性,。因此在采集血標本時，量不能太少,，操作過程中如果血清混濁,，一定要離心后再吸樣，避免紅細胞加入造成假陽性,。對于溶血的標本zui重新采集血液,，進行重新檢測。
2.2 標本凝集不全或標本離心處理時采用不同的離心轉(zhuǎn)速和離心時間,也可造成假陽性結(jié)果,。若在血液還未開始凝固時即強行分離血清,，此時的血清中仍殘留部分纖維蛋白原，在ELISA測定過程中可以形成肉眼可見的纖維蛋白塊,，易造成假陽性結(jié)果,；離心轉(zhuǎn)速過低或離心時間過短，由于血液離心不充分均可導(dǎo)致假陽性,。解決的辦法zui是血液標本采集后放水浴箱,，使其充分凝固再用3000rpm,離心15分鐘再分離血清。
2.3 干擾物質(zhì)的影響：如類風(fēng)濕因子（RF）,、補體,、AFP等可以造成HBsAg檢測結(jié)果假陽性。RF因子可與標記二抗的Fc段結(jié)合造成假陽性,；補體從C1q活化,，使一抗和酶標二抗的抗體分子發(fā)生變構(gòu)，Fc的C1q分子結(jié)合點暴露出來,，則補體C1q可將二者連接起來造成假陽性,，采用56。C30分鐘滅活補體可降低假陽性率,；高濃度的AFP（如孕婦）,，在儲存過程中可能形成二聚體會導(dǎo)致本底過深造成假陽性結(jié)果。
2.4 某些細菌污染標本(如表皮球菌等),菌體中可能含有內(nèi)源性HRP,，造成檢測結(jié)果假陽性,。