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植物蛋白提取實(shí)驗(yàn)說(shuō)明
閱讀：805 發(fā)布時(shí)間：2023-9-4植物蛋白提取試劑適用于多種植物根，莖,，葉及果實(shí)等的新鮮或凍存組織,。植物組織成分復(fù)雜，含有較多酚類(lèi)物質(zhì),、多糖,、色素、次生代謝物質(zhì)等,，致使植物蛋白質(zhì)的分離提取變得困難和復(fù)雜。本試劑采用優(yōu)化的試劑和程序,，能有效提取多種植物中的可溶性和疏水性蛋白成分,，有效去除植物組織所含的多酚,、多糖、醌,、色素,、脂質(zhì)、次生代謝物質(zhì)等干擾蛋白質(zhì)研究的成分,，使提取的蛋白質(zhì)處于蕞佳的活性狀態(tài)和檢測(cè)狀態(tài),，適應(yīng)于酶學(xué)活性測(cè)定，單向及雙向蛋白電泳,，Western Blot和免疫共沉淀分析等蛋白質(zhì)研究實(shí)驗(yàn),。
組成和規(guī)格：無(wú)色透明的提取試劑50 ml或100 ml。
貯存：4°C,，密封避光1年,。
用途：提取多種植物組織和細(xì)胞的可溶性和疏水性蛋白。如蘋(píng)果,、花生,、土豆、煙葉,、菠菜,、梅花等。
操作步驟：
1. 組織勻漿,，必須充分勻漿,，此步驟非常關(guān)鍵：
(1) 凍存組織勻漿：預(yù)先將研缽置于－20°C ~－70°C冰箱內(nèi)冷凍。取液氮凍存的植物組織,，放入冰凍的研缽內(nèi)研磨至粉末狀,，注意使組織一直處于冰凍狀態(tài)，如組織顏色加深或變黑通常表明組織已融化,。將研磨好的組織轉(zhuǎn)移到EP 管中,，按每200 mg植物組織加500 ul的比例加提取試劑，混勻后冰上放置20分鐘,，其間可數(shù)次顛倒混勻,，以便蛋白溶解。
(2) 新鮮組織勻漿：取新鮮組織放入研缽中,，按每200 mg植物組織加500ul的比例加提取試劑,，充分研磨使勻漿液中看不到大的塊狀或片狀組織，保證組織研磨破碎,。轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi),，冰上放置20分鐘。
2. 離心：12000 g離心15分鐘，棄去沉淀,。蛋白在上清中,。
3. 取離心后的上清，轉(zhuǎn)移至新管,，立即使用或－70°C凍存,。通常上清內(nèi)植物色素已基本去除，如有少量殘留亦不影響蛋白定量及電泳實(shí)驗(yàn),。建議用BCA方法進(jìn)蛋白定量（我公司的BCA蛋白定量試劑盒#P1511）,。
如進(jìn)行雙向電泳或欲che底清除色素等雜質(zhì)可進(jìn)行以下內(nèi)驟:
1. 取上清液加入4倍體積的丙酮或甲醇混勻，－20°C至少一小時(shí)以充分沉淀蛋白質(zhì),。
2. 12000 g離心15分鐘沉淀蛋白,。
3. 棄去上清。自然干燥蛋白沉淀,，依據(jù)試驗(yàn)將沉淀溶于相應(yīng)的緩沖液,。如進(jìn)行Western Blot 亦可用提取試劑溶解。
常見(jiàn)問(wèn)題及解決方法：
1. 提取的蛋白量少：
1) 組織蛋白含量較少,，如水果等,，可增加組織量；
2) 組織勻漿不充分,，如纖維較多的組織,，破碎較困難，應(yīng)適當(dāng)延長(zhǎng)勻漿時(shí)間,；
3) 組織過(guò)老或水分丟失致使其干燥,，故盡量選用新鮮較嫩的組織；
4) 甲醇或丙酮沉淀后蛋白溶解不充分,，應(yīng)延長(zhǎng)溶解時(shí)間或使用較強(qiáng)的蛋白溶解劑,。
2. 蛋白質(zhì)量不佳：
1)提取的蛋白有多酚或色素等雜質(zhì)殘留，可重復(fù)用丙酮或甲醇沉淀,；
2) 蛋白質(zhì)降解,，操作各步驟均應(yīng)在冰上進(jìn)行；加入蛋白酶抑制劑,。