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酶法提取膠原蛋白的方法介紹
閱讀：1314 發(fā)布時(shí)間：2023-8-8酶法提取是指可溶性膠原和酸溶性膠原被提取后,，需用一些蛋白酶，如膠原酶,、胃蛋白酶,、木瓜蛋白酶和胰凝乳蛋白酶等水解，得到不同的酶促溶性膠原蛋白,。所使用的蛋白酶主要分3種：動(dòng)物蛋白酶（如胰蛋白酶,，胃蛋白酶），植物蛋白酶（如木瓜蛋白酶,，菠蘿蛋白酶）,，微生物蛋白酶（如堿性蛋白酶，中性蛋白酶）。在對(duì)酶法水解膠原蛋白的研究中,，以堿性蛋白酶應(yīng)用zui多,。
將膠原進(jìn)行限制性降解，即將末端肽切割下來,，由于膠原肽鏈間的共價(jià)鍵都是通過分子末端肽里的賴氨酸或羥賴氨酸的相互作用形成的,，末端肽被切下后，含三螺旋結(jié)構(gòu)的主體部分可溶于稀有機(jī)酸而被提取出來,。用酶處理,，可以水解掉膠原纖維蛋白的末端肽，提高膠原蛋白的產(chǎn)率,；而且還不會(huì)破壞膠原蛋白的三股螺旋結(jié)構(gòu),，保持其特性。影響酶提取的因素有很多,，如酶濃度,、酶與底物的比例、酶解時(shí)間,、酶解溫度,、pH值以及料液比等。在實(shí)際操作中,，大多數(shù)采用酶復(fù)合法提取膠原蛋白,，較多的是使用胃蛋白酶提取，有機(jī)酸多為乙酸,。
酶解膠原蛋白的工藝主要分為單酶水解法和多酶水解法,。多酶水解法又分為混合酶水解法（比如牛胰蛋白酶，鏈霉菌蛋白酶,，芽孢桿菌蛋白酶混合）和分步酶水解法,，酶法提取皮膠原具體實(shí)驗(yàn)工藝及條件的選取通常應(yīng)考慮要開發(fā)的產(chǎn)品對(duì)分子量的要求，要得到分子量較小的膠原多肽一般采用多酶水解法,。影響酶解效果的因素主要有：酶的種類,、加酶量、酶解溫度,、酶解時(shí)間,、pH值及料水比。采用酶法提取骨料中的膠原蛋白,，既能有效縮短提取時(shí)間,，又能獲得具有良好生物活性的膠原蛋白，而且對(duì)環(huán)境的污染也較小,。膠原蛋白不易被普通蛋白酶水解,，但能被動(dòng)物膠原酶斷裂，斷裂的碎片自動(dòng)變性后可被普通蛋白酶水解。胃蛋白酶水解膠原蛋白的適宜條件為pH 1.65～1.70,、溫度37℃,。
有人以豬骨為原料，用蛋白酶的酶解反應(yīng)代替?zhèn)鹘y(tǒng)制膠工藝,，對(duì)骨膠原的酶解反應(yīng)與酶法制膠工藝進(jìn)行了試驗(yàn)研究,。結(jié)果表明：以胃蛋白酶對(duì)骨膠原的提取率zui高（46.14%），其次是胰蛋白酶（43.42%）,，接下來是中性蛋白酶（30.14%）,，zui后是堿性蛋白酶（21.15%）。并且通過單因素和正交試驗(yàn)對(duì)胃蛋白酶酶解反應(yīng)中各主要影響因素進(jìn)行了優(yōu)化,。試驗(yàn)結(jié)果表明,，胃蛋白酶提取的zui you條件是，胃蛋白酶的濃度是1%,，在pH2.0的條件下酶解48h,，然后在濃度為10%（w/v）的NaCL溶液中鹽析24h，zui后骨膠原的回收率為64.77%,，骨膠原的提取率為49.75%,。還有人用胃蛋白酶提取豬皮膠原蛋白，分別在水解0,、2,、6、10,、14,、18,、22,、26h時(shí)對(duì)四種不同胃蛋白酶用量（分別為1%、2%,、2.5%,、3%）的試樣取樣檢測(cè)，采用一階HILL方程模擬胃蛋白酶提取豬皮膠原蛋白的進(jìn)程以及胃蛋白酶水解速率的衰減過程,，zui后得出2%的胃蛋白酶用量和6-7h的水解時(shí)間提取率zui大,。還有人用以新鮮豬皮為原料，在50-52℃的條件下用胰酶進(jìn)行水解,，在酶用量為 5000：1～10000：1,，pH值為9，反應(yīng)2－3h,，原料：水為1：2的條件下酶解,。結(jié)果表明：總蛋白質(zhì)的提取率≥80%。
采用酶法提取膠原蛋白時(shí)，必須嚴(yán)格控制提取條件：
首先,，酶作用時(shí)間必須適當(dāng),。如果時(shí)間過短，膠原蛋白就不能充分釋放到提取液中,，影響提取率,；如果酶作用時(shí)間過長(zhǎng)，膠原蛋白會(huì)水解過度,，產(chǎn)生過多的苦味小分子低聚肽,，不僅會(huì)增加分離純化的難度，也會(huì)影響膠原蛋白的功能特性和生物活性,。
其次,，酶解溫度要適宜。溫度過低,，酶的作用效果不明顯,；溫度過高會(huì)引起酶的失活和膠原蛋白的變性。據(jù)報(bào)道,，當(dāng)介質(zhì)pH略低于中性時(shí),，膠原蛋白的變性溫度為40～41℃，當(dāng)介質(zhì)pH為酸性時(shí),，膠原蛋白的變性溫度為38～39℃,，而且魚皮膠原蛋白的變性溫度要比豬皮膠原蛋白的變性溫度低7～12℃。所以,，如果要使提取的膠原蛋白具有良好的生物活性,，在提取過程中應(yīng)使提取溫度低于變性溫度。
第三,，需選用適當(dāng)?shù)拿?。一般從陸生哺乳?dòng)物組織中提取膠原蛋白時(shí)，采用胃蛋白酶在其zui適作用溫度下進(jìn)行提取是合理的,，但對(duì)于魚類等水生動(dòng)物,，由于其膠原蛋白的變性溫度比陸生哺乳動(dòng)物低，因此許多蛋白酶便不適用,，如果在這些酶的zui適作用溫度下提取可能會(huì)破壞膠原蛋白的某些功能特性和生物活性,。采用酶法提取膠原蛋白及其多肽的研究主要是從動(dòng)物皮及其加工副產(chǎn)物中，應(yīng)用酶法從動(dòng)物骨中提取膠原蛋白及其多肽報(bào)道較少,。