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  ELISA 是一種敏感性高,、特異性強(qiáng),、重復(fù)性好的實(shí)驗(yàn)診斷方法,，由于其試劑穩(wěn)定、易保存,、操作簡便,、結(jié)果判斷較客觀等因素，以及既適宜于大規(guī)模篩查試驗(yàn)又可以用于少量標(biāo)本的檢測,，既可以做定性試驗(yàn)也可以做定量分析等優(yōu)點(diǎn),，已廣泛應(yīng)用于微生物學(xué)、寄生蟲學(xué),、腫瘤學(xué)和細(xì)胞因子等領(lǐng)域。

一,、原理

    PCRELISA是用免疫學(xué)方法檢測PCR產(chǎn)物,，這比常規(guī)用電泳方法及Southernblot要簡便、省時(shí),，可同時(shí)處理大量標(biāo)本,，便于自動(dòng)化。PCR-ELISA的原理是在做PCR擴(kuò)增時(shí)應(yīng)用生物素（biotin）標(biāo)記的引物,，這樣PCR的產(chǎn)物就可結(jié)合到親和素（avidin）包被的塑料板上,，再用地高辛標(biāo)記的探針與PCR產(chǎn)物雜交，然后就可以用抗地高辛的酶聯(lián)反應(yīng)檢測,。

 

二,、材料、方法和結(jié)果

    1.PCR擴(kuò)增按基本PCR技術(shù)做DNA擴(kuò)增,，只是所用的引物至少有一個(gè)是5′端用生物素標(biāo)記的,。通常可在DNA合成儀上直接合成5′端帶生物素標(biāo)記的引物,。

    2地高辛標(biāo)記的探針雜交將地高辛標(biāo)記的DNA探針01μg稀釋于90μl 50mmol/L TrisHCl,pH值83,80mmol/L KCl中,。取10μl PCR產(chǎn)物加到管中，加熱至90℃,，緩慢冷卻至67℃,。離心1s，置52℃水浴保溫1h,。

3將雜交產(chǎn)物固定到塑料板上①可用商品供應(yīng)的親和素包被的酶標(biāo)板,，亦可用普通酶標(biāo)板按常規(guī)方法將親和素包被上；②每孔加100μl封閉液（含10mg/ml BSA,1mg/ml魚精DNA的PBS）,，室溫1h,；③PBST洗3次；④將地高辛探針雜交的PCR產(chǎn)物直接加到酶標(biāo)板上,，室溫孵育1h,；⑤PBST洗3次,。

4ELISA檢測①將抗地高辛抗體稀釋于PBS中，每孔加100μl,，室溫孵育1h,；②PBST洗3次；③將酶標(biāo)的第二抗體稀釋于PBS中,，每孔加100μl,，室溫孵育1h；④PBST洗3次,；⑤每孔加100μl酶底物,，在顏色適合后終止反應(yīng)；⑥在酶標(biāo)儀上讀結(jié)果,。

 

三,、注意事項(xiàng)

    本法的敏感性可與放射性同位素標(biāo)記相比，但又避免了同位素的危險(xiǎn),。做大量樣品時(shí),，應(yīng)統(tǒng)一配制反應(yīng)液，再小心地分裝到各反應(yīng)管中,，以免污染,，并使各管條件一致。非特異性反應(yīng)常由于地高辛標(biāo)記的DNA探針與酶標(biāo)板直接結(jié)合所致,，因此在封閉液中一定要包括足量的魚精DNA,。