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ELISA技術綜述（五）
閱讀：746 發(fā)布時間：2023-6-5其他內(nèi)容：
酶聯(lián)免疫測定技術的多酶級聯(lián)放大系統(tǒng)：
一,、AP底物放大系統(tǒng)
substrate ampiification system
AP可催化底物NADP+脫磷酸而生成NAD+(輔酶1),，以乙醇作還原劑,，在醇脫氧酶催比下,，乙醇脫氫,，NAD+還原為NADH，NADH在黃遞酶的催 化下脫氫,，同時四唑鹽(tetrazoliim)被還原成有色的甲蠟(formazan),。AP不斷催化NAD+生成，NAD+與NADH循環(huán)轉(zhuǎn)化,，不斷 生成甲蠟,。整個反應周期由AP及醇脫氫酶、黃遞酶組成酶級聯(lián),，每個AP分子每分鐘可催化生成6X104個NAD+分子,，而每個NAD+每分鐘又可使60個 甲臘分子產(chǎn)生。這種由Selfl984年shou次報道的EIA放大系統(tǒng)可使EIA的測定敏感性提高約250倍,。
但Brooks等發(fā)現(xiàn)上述底物反應循環(huán)中產(chǎn)生的乙醛對整個酶級聯(lián)反應有抑制作用,，影響放大效果，而當加入鹽酸氨基脲時,，則可進一步延長反應循環(huán),，從而增加 測定敏感性，這是因為鹽駿氨基脲可與乙醛反應生成縮氨基脲(semicarbatone)和水,，這樣就消除了乙醛對反應的抑制阼用,。應用這種改進方法測定 食物中含蛋白A的金黃色葡萄球菌，測定敏感性從Self原方法的(4～6)X103菌落形成單位(c．{．u)/g或m1,，到20個菌落形成單位 (c．f．u)/g或ml,，測定敏惑性約提高200—300倍。
后來Self等又用刃天青(resazurin)代替其原來放大模式中的四唑鹽,，刃天青在黃遞酶的作用下成為發(fā)出熒光的resorufin,，然后使用熒光比色計測定得到結果,。這種方式的測定敏感性也較原始方法大為提高，每孔內(nèi)僅含約350個AP分子也可測出,。
二,、雙酶級聯(lián)放大系統(tǒng)
dual-enzyme cascade雙酶級聯(lián)放大系統(tǒng)又稱酶抑制級聯(lián)放大系統(tǒng)，酯酶抑制劑4—(3—氧—4,，4,，4—三氟丁基)苯磷駿鹽因其帶有封閉性—P04基團，對酯酶不具抑制活性,，但 當其在AP作用下脫—PO4基時,，失活的抑制劑即成為具活性的抑制劑，使加入的羧酸酯酶失活,，通過顯色反應測定殘留的酯酶活性即可知原始AP的活性,，二者 成反比相關。這種放大系統(tǒng)的測定敏感性較普通方法可提高約125倍,。
三,、酶激活級聯(lián)放大系統(tǒng)
enzymeactivationcascade這亦是一種以AP為標記酶的放大系統(tǒng)。黃素—腺嘌呤二核苷酸磷酸(FADP)在AP的催化下脫磷酸為FAD,，FAD則使脫輔基的氨基酸氧化酶轉(zhuǎn)化為全酶的 氨基酸氧化酶,，后者催化晡氨酸生成H2O2，于是在DCHBS,，4AAP及HRP存在下,，得到有色產(chǎn)物。上述放大系統(tǒng)可測定l{mol/LAP,。
此外,，催化指示物沉著(catalyzedreporterdeposition，CARD)也是一種多酶級聯(lián)EIA放大系統(tǒng),。HRP氧化生物素或熒光素 標記的酪胺所產(chǎn)生的游離基,，可與固相上蛋白的酪氨酸、色氨酸反應而使大量的生物素或熒光素沉著于固相上HRP周圍的區(qū)域內(nèi),，沉著的生物素可用HRP及6— 半乳糖苷酶或AP標記的鏈霉親合素測定,，沉著的熒光素則可用酶標抗熒光素測定,。這樣使得一分子HRP轉(zhuǎn)化為大量的標記物,，從而大為改善(約30倍)EIA 的測定敏感性。Diamandis等使用螯合的Eu3+鏈霉親合素—甲狀腺球蛋白試劑替代上述酶標物測定AFP,，不但提高了測定敏感性,，而且也使背景“噪 聲"較普通方法改善了6～8倍。我們將上述CARD放大系統(tǒng)直接用于HBsAg商品ELISA試劑盒,，在不改變商品試劑盒任何成分和操作步驟的情況下,，可 將試劑盒的測定敏感性提高約5倍,。
四、凝固因子酶級聯(lián)放大系統(tǒng)
脂多糖(1ipopolysaccharide,，LPS)可激活鱟血細胞裂解物的凝固級聯(lián)反應,。首先LPS使因子C激活為C，后者又激活因子B為B,，B使 前凝固酶轉(zhuǎn)化為凝固酶,，凝固酶則催化底物(Boc-Le，u-Gly-Arg-p)產(chǎn)生有色的對硝基苯胺(曠 nitroa·niline,，PNA),，A405nm測定。因此,，在免疫測定中,，如以LPS作為標記物標記抗體，則可通過上述反應使測定敏感性放大,，可檢 出10-7～10-11g／m1的IgG和10-7～10-11g／ml的抗IgG,，Seki等將上述方法用于雙夾心法檢測HBsAg，敏感性達 10-10～10-12g／ml,。
五,、免疫復合物轉(zhuǎn)移兩位點酶免疫試驗
一般來說，在酶免疫測定中,，限制測定敏感性的一個重要因素是非特異地結合于固相的標記酶的顯色反應,，因其會使背景顯色加深，從而掩蓋了低濃度待測物所致的 特異顯色,，解決這個問題提高測定敏感性的一條途徑是將待測物——抗體—酶復合物從固相上洗提至另一個固相,，使用一雙標抗體[如生物素和二硝基苯(DNP) 標記的抗體]和一酶標抗體即可達到這個目的，在液相中形成的免疫復合物(雙標抗體：抗原：抗體：酶)捕獲于DNPIgG包被的聚苯烯珠上,，洗滌后,，使用二 硝基苯—L—賴氨酸將其從固相上取代下來，然后再將上述免疫復合物捕獲于鏈霉親合素包被的聚苯烯珠上,，最后進行酶反應顯色測定,。Hashida和 shikawa使用該方法測鐵蛋白敏感性達到1zeptomole(1X10-21mol，約600個分子),，較常規(guī)方法提高了30倍,。眾多的研究者用該 方法測定抗甲狀腺球蛋白IgC及抗HTLV—1 IgG和抗HIV-1 IgG，敏感性均遠遠地超過常規(guī)方法,，取得了良好的效果,。
此外，Domingo和Marco等在進行點免疫結合試驗時,，以4—氯—1—萘酚作為HRP的底物,，反應后得到的不可溶產(chǎn)物因其具有特殊的紫外吸收及熒光 幻滅特征而可在紫外燈下觀察結果。由于沉著于膜上的物質(zhì)是HRP反應的中間產(chǎn)物,，而非可見光下能見到的最終產(chǎn)物,，所以可大幅度地提高這種固相免疫測定的敏 感性,，較常規(guī)方法約增加100倍,。至于酶脂質(zhì)體放大系統(tǒng)(1iposomeamplificat*tem)，也是一種新型高效的EIA測定放大 系統(tǒng),。
綜上所述,，EIA測定放大方式雖然多種多樣,，且不斷推陳出新，但研究者的出發(fā)點無非是一方面極力降低影響測定敏感性的非特異顯色,，如通過 增加操作步驟而達到上述目的的免疫復合物轉(zhuǎn)移兩位點酶免疫試驗,；另一方面則是通過質(zhì)量提高的信號，從而達到提高敏感性的目的,，如增加反應層次的生物素—親 合素,，多酶級聯(lián)等放大系統(tǒng)。但嚴格地講,，真正稱得上是EIA測定放大系統(tǒng)的僅限于后者,，前者還只能說是一種所謂的超敏感 EIA(uhrasensitive enzyme immunoassay)。至于利用酶反應產(chǎn)物特征改變檢測手段(如發(fā)光或熒光檢測)而使EIA測定敏感性提高,，則只不過是依靠儀器開闊了“視野“而已,。