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ELISA技術(shù)綜述（四）
閱讀：784 發(fā)布時間：2023-5-292.4 結(jié)合物的保存
酶標抗體中的酶和抗體均為生物活性物質(zhì)，保存不當,，極易失活,。高濃度的結(jié)合物較為穩(wěn) 定，冰凍干燥后可在普通冰箱中保存一年左右,，但凍干過程中引起活力的減低，而且使用時需經(jīng)復溶,，頗為不便,。結(jié)合物溶液中加入等體積的甘油可在低溫冰箱或普 通冰箱的冰格中較長時間保存。早期的ELISA試劑盒中的結(jié)合物一般均按以上兩種形式供應(yīng),，配以稀釋液（見3.2.5）臨用時按標明的稀釋度稀釋成工作 液?，F(xiàn)在較先進的ELISA試劑盒均已用合適的緩沖液配成工作液，使用時不需再行稀釋,，在4-8℃保存期可達6個月,。由于蛋白質(zhì)濃度較低，結(jié)合物易失活,， 需加入蛋白保護劑,。另外再加入抗生素（例如慶大霉素）和防腐劑（HRP結(jié)合物加硫柳泵，AP結(jié)合物可加疊氮鈉）,，以防止細菌生長,。
2.5 結(jié)合物的稀釋液
用于稀釋高濃度的結(jié)合物以配成工作液。為避免結(jié)合物在反應(yīng)中直接吸附在固相載體上,，在稀釋緩沖液中常加入高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)（例如1%牛血清白蛋白）,， 通過競爭以抑制結(jié)合物的吸附。一般還加入具有抑制蛋白質(zhì)吸附于塑料表面的非離子型表面活性劑,，如吐溫20,，0.05%的濃度較為適宜。在間接測定抗體時,， 血清標本需稀釋后進行測定,，也可應(yīng)用這種稀釋液。
3. 酶的底物
3.1HRP的底物
HRP催化過氧化物的氧化反應(yīng),，具代表性的過氧化物為H2O2,，其反應(yīng)式如下：
DH2+ H2O2 D+ H2O
上式中，DH2為供氧體,，H2O2為受氫體,。在ELISA中，DH2一般為無色化合物，經(jīng)酶作用后成為有色的產(chǎn)物,，以便作比色測定,。常用的供氫體有鄰苯 二胺(O-phenylenediamine,OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine,TMB)和 ABTS[2,2'-azino-di-(3-ethylbenziazobine sulfonate-6)],。
OPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅 色,，用酸終止酶反應(yīng)后，在492nm處有最高吸收峰,，靈敏度高,，比色方便，是HRP結(jié)合物常用的底物,。OPD本身難溶于水,，OPD·2HCL為水溶性。 曾有報道OPD有致異變性,，操作時應(yīng)予注意,。OPD見光易變質(zhì)，與過氧化氫混合成底物應(yīng)用液后更不穩(wěn)定,，須現(xiàn)配置現(xiàn)用,。在試劑盒中，OPD和H2O2一般 分成二組分,，OPD可制成一定量的粉劑或片劑形式,，片劑中含有發(fā)泡助溶劑，使用更為方便,。過氧化氫則配入底物緩沖液中,，有制成易保存的濃縮液，使用時用蒸 餾水稀釋,。先進的ELISA試劑盒中則直接配成含保護劑的工作濃度為0.02% H2O2的應(yīng)用液,，只需加入OPD后即可作為底物應(yīng)用液。
TMB經(jīng)HRP作用后共產(chǎn)物顯藍色,，目視對比鮮明,。TMB性質(zhì)較穩(wěn)定，可配成溶液試劑,，只需與H2O2溶液混和即成應(yīng)用液,，可直接作底物使用。另 外,，TMB又有無致癌性等優(yōu)點,，因此在ELISA中應(yīng)用日趨廣泛。酶反應(yīng)用HCL或H2SO4終止后,，TMB產(chǎn)物由藍色呈黃色,，可在比色計中定量,，最適吸 收波長為405nm。
ABTS雖不如OPD和TMB敏感,，但空白值極低,，也為一些試劑盒所采用。
另一種HRP的底物為3-(4-羥基)苯丙酸[3-(4-hydroxy)phenly propionic acid,HPPA],，經(jīng)HRP作用后,，產(chǎn)物顯熒光，可用熒光光度計測量,。用于ELISA的優(yōu)點為可加寬定量測定的線性范圍,。
HRP對氫受體的專一性很高，僅作用于H2O2,、小分醇的過氧化物和尿素過氧化物(urea peroxide),。H2O2應(yīng)用最多，但尿素過氧化物為 固體,，作為試劑較H2O2方便、穩(wěn)定,。試劑盒供應(yīng)尿素過氧化物片劑,，用蒸餾水溶解后，在底物緩沖液中密閉,、低溫（2～8℃）可穩(wěn)定1年,。
3.2 AP的底物
AP為磷酸酯酶，一般采用對硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate,p-NPP)作為底物,，可制成片劑,，使用方便。產(chǎn)物為黃色 的對硝基酚,，在405nm波長處有吸收峰,。用NaOH終止酶反應(yīng)后，黃色可穩(wěn)定一時間,。AP也有發(fā)熒光底物（磷酸4-甲基傘酮）,，可用于ELISA作熒光 測定，敏感度較高于用顯色底物的比色法,。
4. 洗滌液
在板式ELISA中,，常用的稀釋液為含0.05%吐溫20磷酸緩沖鹽水。
5. 酶反應(yīng)終止液
常用的HRP反應(yīng)終止液為硫酸,，其濃度按加量及比色液的最終體積而異,，在板式ELISA中一般采用2mol/L。
6. 陽性對照品和陰性對照品
陽性對照品(positive control)和陰性對照品(negative control)是檢驗試驗有效性的控制品,，同時也作為判斷結(jié)果的對 照,，因此對照品,，特別是陽性對照品的基本組成應(yīng)盡量與檢測標本的組成相一致。以人血清為標本的測定,，對照品最好也為人血清,，因為正常人血清在各種 ELISA模式中可產(chǎn)生不同程度的本底。由于大量正常人血甭較難得到,，國外試劑盒中的對照品多以復鈣人血漿 (recalcified human plasma)為原料,，即在血漿中加入鈣離子，使其中的纖維蛋白質(zhì)凝固,，除去凝塊后所得的液體,，其組成與血清相 似。陰性對照品須先行檢測,，確定其中不含待測物質(zhì),。例如HBsAg檢測的陰性對照品中不可含HBsAg，最好抗HBs也是陰性,。陽性對照品多以含蛋白保護劑的緩沖液為基質(zhì),，其中加入一定量的待檢物質(zhì)，此量最好在試劑說明書中標明,。加入的量應(yīng)與試劑的敏感度相稱,，在測定中得到的吸光值與受檢標本吸光值比較， 可對標本中受檢物質(zhì)的量有一個粗略的估計,。國外檢測HBsAg的ELISA試劑盒檢測敏感度約為0.5ng/ml,，陽性對照品中含量約為10ng/ml。 在對照品中一般加入抗生素和防腐劑,，以利保存,。
7. 參考標準品
定量測定的ELISA試劑盒（例如甲胎蛋白質(zhì)癌胚抗原測定等）應(yīng)含有制作標準曲線用的參考標準品，應(yīng)包括覆蓋可檢測范圍的4-5個濃度,，一般均配入含蛋白保護劑及防腐劑的緩沖液中,。