化工儀器網(wǎng)
技術(shù)文章
ELISA技術(shù)綜述（二）
閱讀：730 發(fā)布時(shí)間：2023-5-15ELISA的商品化試劑盒成分和分類：
在臨床檢驗(yàn)或者科研檢測中,，ELISA 實(shí)驗(yàn)通常有商品試劑盒提供。ELISA試劑盒中有三個(gè)必要的試劑：免疫吸附劑,、結(jié)合物和酶的底物等,。
完整的ELISA試劑盒包含以下各組分：（1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；
（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體（結(jié)合物）,；
（3）酶的底物,；
（4）陰性對照品和陽性對照品（定性測定中）,，參考標(biāo)準(zhǔn)品和控制血清（定量測定中）；
（5）酶聯(lián)物（結(jié)合物）及標(biāo)本的稀釋液,；
（6）洗滌液,；
（7）酶反應(yīng)終止液。
1,、免疫吸附劑
已包被抗原或抗體的固相載體在低溫（2~8℃）干燥的條件下一般可保存6個(gè)月以上,。有些不完整的試盒，僅供應(yīng)包被用抗原或抗體,，檢測人員需自行包被,。
1.1 固相載體
固相載體在ELISA測定過程中作為吸附劑和容器，不參與化學(xué)反應(yīng),?？勺?span style="font-size: 18px; font-family: Calibri;">ELISA中載體的材料很多常用的是聚苯乙烯。聚苯 乙烯具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能,，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后仍保留原來的免疫學(xué)活性,，加之它的價(jià)格低廉，所以被普遍采用,。聚苯乙烯為塑料,，可制成各種形式。
ELISA載體的形狀主要有三種：微量滴定板,、小珠和小試管,。以微量滴定板最為常用，專用于EILSA的產(chǎn)品稱為ELISA板,，國際上標(biāo) 準(zhǔn)的微量滴定板為8×12的96孔式,。為便于作少量標(biāo)本的檢測，有制成8聯(lián)孔條或12聯(lián)孔條的,，放入座架后,，大小與標(biāo)準(zhǔn)ELISA板相同。ELISA板的 特點(diǎn)是可以同時(shí)進(jìn)行大量標(biāo)本的檢測,，并可在特制的比色計(jì)上迅速讀出結(jié)果?，F(xiàn)在已有多種自動(dòng)化儀器用于微量滴定板型的ELISA檢測，包括加樣,、洗滌,、保 溫、比色等步驟,，對操作的標(biāo)準(zhǔn)化極為有利,。聚苯乙烯經(jīng)射線照射后，其吸附性能特別是對免疫球蛋白的吸附性能增加,，應(yīng)用于雙抗體夾心法可使固相上抗體量增 多,，但用于間接法測抗體時(shí)空白值較大,。
良好的ELISA板應(yīng)該是吸附性能好，空白值低,，孔底透明度高,，各板之間、同一板各孔之間,、同一板各孔 之間性能相近,。聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工藝的差別，各種產(chǎn)品的質(zhì)量差異很大,，因此,，每一批號的ELISA板在使用前須事先檢查其性能。 常用的檢查方法為：以一定濃度的人IgG（一般為10ng/ml）包被ELISA板各孔,，洗滌后每孔內(nèi)加入適當(dāng)稀釋度的酶標(biāo)抗人IgG抗體,，保溫后洗滌， 加底物顯色,，終止酶反應(yīng)后,，分別測每孔溶液的吸光度?？刂品磻?yīng)條件,，使各孔讀數(shù)在吸光度0.8左右。計(jì)算全部讀數(shù)的平均值,。所有單個(gè)讀數(shù)與全部讀數(shù)的均數(shù) 之差,，應(yīng)小于10%。
與聚苯乙烯類似的塑料是聚氯乙烯,。作為ELISA固相載體,，聚氯乙烯的特點(diǎn)為質(zhì)軟板薄，可剪割,，價(jià)廉,，但光潔度不如聚苯乙烯板，孔底亦不如聚苯乙烯平整,。聚氯乙烯對蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高,，但空白值也略高。
為比較不同固相在某一ELISA測定中的優(yōu)劣,，可應(yīng)用如下的試驗(yàn)：用其他免疫學(xué)測定方法選出一個(gè)典型的陽性標(biāo)本和陰性標(biāo)本，將它們進(jìn)行一系列稀釋后,，在 不同的固相載體上按預(yù)定的ELISA操作步驟進(jìn)行測定,，然后比較結(jié)果。在哪一種載體上陽性結(jié)果與陰性結(jié)果差別最大,，這種載體就是這一ELISA測定項(xiàng)目的 最合適的固相載體,。
在ELISA中,，用作固相載體的小珠一般為直徑0.6cm的圓珠，表面經(jīng)磨砂處理后吸附面積大大增加,。ELISA板孔的吸 附面積約為200mm2,，小珠均為1000mm2，將近ELISA板孔的5倍,。吸附面積的增大即意味著固相抗原或抗體量的增加,。再者，球型小珠的表面弧度 更有利于吸附的抗原決定簇或抗體結(jié)合位點(diǎn)的暴露面處于最佳反應(yīng)狀態(tài),，因此珠式ELISA的反應(yīng)往往更為靈敏,。小珠的另一特點(diǎn)是更易于使洗滌che底，使用特殊 的洗滌器,，使小珠在洗滌過程中滾動(dòng)淋洗,，其洗滌效果遠(yuǎn)較板孔的浸泡式為好。但由于磨砂工藝的難度較大,，小珠的均一性較差,。
小試管作為固相載體也有較大的吸附表面，而且標(biāo)本的反應(yīng)量也相應(yīng)增加,。板式及珠式ELISA的標(biāo)本量一般為00-200ul,，而小試管可根據(jù)需要加大反應(yīng)體積，標(biāo)本反應(yīng)量的增加有助于試驗(yàn)敏感性的提高,。小試管還可以當(dāng)作比色杯,，最后直接放入分光光度計(jì)中比色。
也有應(yīng)用聚苯乙烯膠乳或其他材料制成的微粒作為ELISA固相載體的,。其優(yōu)點(diǎn)是表面積極大,，反應(yīng)在懸液中進(jìn)行，其速率與液相反應(yīng)近似,。以含鐵的磁性微粒作為ELISA固相載體,，反應(yīng)后用磁鐵的吸引進(jìn)行分離，洗滌方便,，試劑盒一般均配以特殊儀器,。
應(yīng)用于科研領(lǐng)域，定量檢測的試劑盒,，對固相載體的要求比較高,，一般采用nunc 或者costar，或者其他品牌的酶標(biāo)板,，來進(jìn)行包被,。