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ELISA中分析非特異性顯色
閱讀：725 發(fā)布時間：2023-4-19酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)自1971年自問世以來，以其敏感性高,，特異性強(qiáng),，操作簡便、安全,，而廣泛應(yīng)用于臨床診斷,，開創(chuàng)了免疫學(xué)診斷的新紀(jì)元。但同其它免疫診斷方法一樣酶免試劑在它的研究,、生產(chǎn)及使用中常常會碰到非特異性問題,。
1、試劑盒特異性因素
1,、1 固相載體的選擇,。ELISA中常用的固相載體有微量滴定板、小珠和小試管三種,，以微量滴定板最為常見[1],。它具有良好的吸附性能，孔底透明度高,，空白值低,，各板之間、同一板各孔之間性能相近,。聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工藝的差別,，各產(chǎn)品的質(zhì)量差異很大。因此,，在選擇試劑盒同時要對其使用的微孔板型號進(jìn)行認(rèn)證,，評估。
1,、2包被物的純度,。在酶聯(lián)免疫測定尤其是間接ELISA中，試劑的特異性取決于使用抗原的純度,。目前由于技術(shù)條件的限制,，包被用抗原或抗體的純度不可能達(dá)到100%，所以有些非特異性顯色不可避免,，只能盡可能提高純度,，提高特異性。目前使用的包被抗原一般為合成多肽抗原。
1,、3包被抗體的效價,。具有高親和力和高特異性的包被抗體，是決定試劑特異性的重要方面,。
1,、4 封閉。是ELISA中重要的一步,，目的是封閉固相載體表面尚未被所占據(jù)的空隙[2],，減少后續(xù)步驟中非特異性蛋白的干擾。
2,、檢驗標(biāo)本中含有酶標(biāo)記物的干擾物
2,、1內(nèi)源性干擾物：類風(fēng)濕因子(RF)、黃疸等,，類風(fēng)濕因子是可作用于多種動物以及人IgGFc段的自身抗體,，多數(shù)為IgM類，能充當(dāng)抗原成分與固相及酶標(biāo)抗體反應(yīng),，從而呈現(xiàn)非特異性顯色,。
黃疸血標(biāo)本中常含有內(nèi)源性過氧化物酶，如用辣根過氧化物酶為標(biāo)記物,，就有可能產(chǎn)生非特異性顯色,。
2、2 外源性干擾物,，常常因樣品采集、貯存,、處理不當(dāng)造成如樣品溶血,，被細(xì)菌污染，標(biāo)本凝集不全等,。溶血標(biāo)本,，紅細(xì)胞溶解破裂，釋放出血紅素形成,，而血紅素中的鐵卟啉是過氧化物酶的類似物,，以HRP為標(biāo)記的ELISA測定中，溶血標(biāo)本可能會增加非特異性顯色,。如有細(xì)菌污染,，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP(辣根過氧化酶)[2]，有國內(nèi)報道酶免HAg試劑檢測溶血標(biāo)本時可造成假陽性[3],。如在冰箱中保存過久,，其中的IgG可發(fā)生聚合，在間接法ELISA中可使本底加深[2],。因此,，血標(biāo)本在采集處理時應(yīng)小心,，在冰箱中保存不易過久。
標(biāo)本凝集不全時,，血清中會殘留部分纖維蛋白原,，也易造成假陽性。
3,、操作過程中的問題造成假陽性
3,、1加樣
對于間接ELISA標(biāo)本一般都要進(jìn)行稀釋，如果加樣不準(zhǔn)就會造成誤差,，尤其當(dāng)稀釋倍數(shù)大時,，很小的絕對誤差，會導(dǎo)致較大的相對誤差,，使陰性(或弱陽性)標(biāo)本呈陽性(或陰性),。加樣時應(yīng)將所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部,，并注意不可濺出,，不可產(chǎn)生氣泡。目前,，大部分血站都已使用全自動酶免加樣系統(tǒng)處理標(biāo)本,，可較好地避免以上誤差。
3,、2洗滌
在ELISA中正確的洗滌是保證得到可重復(fù)結(jié)果的關(guān)健一步,，應(yīng)引起操作者重視。無論是手工操作還是機(jī)器操作,，得出不正確的結(jié)果常與不正確的洗滌有關(guān),，ELISA就是靠洗滌來達(dá)到分離游離和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。通過洗滌以消除殘留在板孔中沒能與固體抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì),，以及在反應(yīng)過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì),。
3、3 溫育
每種試劑都有其最佳反應(yīng)模式,，其中溫度和溫育時間控制是重要因素,。因孵育溫度高，反應(yīng)時間長,，會造成整板本底高,，陽性率高。溫育一般用濕盒或水浴,，反應(yīng)板不宜疊放,，以保證各板溫度都能迅速平衡，為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋,。
3,、4酶標(biāo)儀判讀
作為記錄測定結(jié)果的儀器，酶標(biāo)儀的性能穩(wěn)定與否,，決定結(jié)果的可靠度,。首先酶標(biāo)儀應(yīng)定期進(jìn)行保養(yǎng)，對濾光片要定期校正,；其次酶標(biāo)儀波長設(shè)置要正確,，最好使用雙波長，一個檢測波長,，一個參比波長,，以消除微孔板底部劃痕、不平,、指印或液面高度差異造成的光干擾,。此外，在用酶標(biāo)儀讀數(shù)時最好先擦試微孔板底部并壓平板條,。由于各種酶標(biāo)儀性能有所不同,。