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酶法試劑盒（ELISA）操作步驟
閱讀：3801 發(fā)布時間：2020-12-9一,、實驗原理
酶法試劑盒（ELISA）實驗原理是使抗原或抗體結合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性,；使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體,，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性,。
在測定時,，把受檢標本（測定其中的抗體或抗原）和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他物質分開,，后結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例,。加入酶反應的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a物,，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關,，故可根據顏色反應的深淺刊物定性或定量分析。由于酶的催化頻率很高,，故可ji大地地放大反應效果,，從而使測定方法達到很高的敏感度。
二,、酶法試劑盒（ELISA）操作步驟
1.ELISA在操作前試劑和組分都先恢復到室溫,，標準品,、質控品和樣品，建議做復孔,。按前面試劑準備中描述的方法,，配制好試劑盒各種組分的工作液。從鋁箔袋中取出所需板條,，剩余的板條用自封袋密封放回冰箱,。
2.設置標準品孔、樣本孔和空白孔,，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL,，樣本孔加待測樣本50μL，空白孔不加,。除空白孔外,，標準品孔和樣本孔，加入辣根過氧化物酶標記的檢測抗體100μL,。用封板膜蓋住反應板,，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
3.溫育好后揭開封板膜,，棄去液體,，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液,，靜置20s,，甩去洗滌液，吸水紙上拍干,。如此重復4次（共洗板5次）,。若使用自動洗板機，請按洗板機操作程序進行洗板,，添加浸泡20s的程序,，可以提高檢測的精度。洗板結束,，加底物前,，要在干凈不掉屑的紙上，充分拍干反應板,。洗滌在ELISA過程中雖不是一個反應步驟,，但卻決定著實驗的成敗。ELSIA就是靠洗滌來達到分離游離的和結合的酶標記物的目的,。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結合的物質,，以及在反應過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質。聚苯乙烯等塑料對蛋白質的吸附是普遍性的，而在洗滌時應把這種非特異性吸附的干擾物質洗滌下來,。可以說在ELISA 操作中,，洗滌是主要的關鍵技術,，應引起操作者的高度重視，操作者應嚴格按要求洗滌,，不得馬虎,。
4.洗板好后將底物A和B按1:1體積充分混合，所有孔中加入底物混合液100μL,。用封板膜蓋住反應板,，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育15min。所有孔加入終止液50μL,，在酶標儀上讀取各孔吸光度（OD值）,。
5.檢測完成后，以標準品濃度做為縱坐標,，對應的吸光度（OD值）作為橫坐標,，利用計算機軟件，采用四參數Logistic曲線擬合（4-pl）,，創(chuàng)建標準曲線方程,，通過樣本的吸光度（OD值），利用方程計算樣品的濃度值,。如果樣品被稀釋,，通過上述方法測的的濃度值，要乘以稀釋倍數,，才是樣品的終濃度,。
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