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實驗原理：ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記,。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性,，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性,。

實驗材料：抗原 ,，血清，96孔酶標(biāo)板 4℃冰箱 ,，恒溫培養(yǎng)箱 ，分光光度計,。

 

實驗步驟：

一,、包被抗原

1. 用50mM 的碳酸鹽包被緩沖液（pH 9.6）溶解抗原，使抗原濃度為10-20 μg/ml,，加100 μl/孔到96 孔酶標(biāo)板,，4℃放置過夜。

2. 第二天棄去包被液后,，用PBST 洗滌3 次,，每孔加入150 μl 1％ BSA 37℃封閉1 小時。

3. PBST 洗滌3 次后,，每孔加入100 μl 不同倍比稀釋度的血清,，并加入對照樣品，37℃孵育2 小時,。

4. PBST 洗滌5 次后,，加入100μl 稀釋后的HRP 標(biāo)記的二抗，37℃孵育1 小時,。

5. PBST 洗滌5 次后,，顯色劑顯色20 min 后，酶標(biāo)儀上讀取A405 吸收值,。

二,、包被細(xì)胞 

1. 在96 孔培養(yǎng)板上接種細(xì)胞數(shù)為1 x 104 cells/well，37℃過夜培養(yǎng),。

2. 第二天用PBS 洗滌培養(yǎng)板2-3 次,。

3. 加入125 μl/well 10% Forma lin（1:10 稀釋）, 室溫下固定15 min。

4. 用ddH2O 洗滌培養(yǎng)板3 次,，并晾干,，儲藏在2-8℃?zhèn)溆谩?/span>

5. 用PBST 洗滌3 次,，每孔加入150 μl 1％ BSA 37℃封閉1 小時。

6. PBST 洗滌3 次后,，每孔加入100 μl 不同倍比稀釋度的血清,，并加入對照樣品，37℃孵育2 小時,。

7. PBST 洗滌5 次后,，加入100 μl 稀釋后的HRP 標(biāo)記的二抗,37℃孵育1 小時。

8. PBST 洗滌5 次后,，顯色劑顯色20 min 后,，酶標(biāo)儀上讀取A405 吸收值。50mM 的碳酸鹽包被緩沖液：0.05mol/L pH9.6 碳酸緩沖液,4℃,，保存,Na2CO3 0.15 克, NaHCO3 0.293 克,蒸餾水稀釋至100 ml,。                                                                                                             

注：ABTS 作為底物進(jìn)行顯色反應(yīng)(10ml)：0.2M Na2HPO4 2.4ml；0.1M 檸檬酸2.6ml,；ddH2O 5ml,；ABTS 5mg；H2O2(30%) 4 ul（用前加入）,。

注意事項：血清標(biāo)本宜在新鮮時檢測,。如有細(xì)菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP,，也會產(chǎn)生假陽性反應(yīng),。如在冰箱中保存過久，其中的可發(fā)生聚合,，在間接法ELISA中可使本底加深,。一般說來，在5天內(nèi)測定的血清標(biāo)本可放置于4℃,，超過一周測定的需低溫冰存,。凍結(jié)血清融解后，蛋白質(zhì)局部濃縮,，分布不均,，應(yīng)充分混勻宜輕緩，避免氣泡,，可上下顛倒混和,，不要在混勻器上強(qiáng)烈振蕩?；鞚峄蛴谐恋淼难鍢?biāo)本應(yīng)先離心或過濾,，澄清后再檢測。反復(fù)凍融會使抗體效價跌落，所以測抗體的血清標(biāo)本如需保存作多次檢測,，宜少量分裝冰存,。保存血清自采集時就應(yīng)注意無菌操作，也可加入適當(dāng)防腐劑,。

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