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干貨:ELISA實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)總結(jié)
閱讀：2227 發(fā)布時(shí)間：2019-8-22ELISA試劑盒在操作過程中總是會出現(xiàn)或大或小的問題，比如說花板,、假陽性、全顯色,、信號值比空白還低等等,。我司技術(shù)人員為大家總結(jié)經(jīng)驗(yàn)了！
以下是做ELISA試劑盒的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)：
一,、包被原
包被原的性質(zhì)很重要,，蛋白濃度，是否降解,，這關(guān)系到做出的抗體可不可以被其識別,，所以保存抗原很重要，做重組蛋白時(shí),，一定要在冰浴下緩慢融化,。還有有的包被原可能不是蛋白,，對于生物素和脂類物質(zhì)或小分子物質(zhì)要事先對其改造再加以包被。
方法簡要的列出如下：
①親和素生物素：先親和素先包被載體,，加入生物素化的DNA,，這種包被方法均勻、牢固,，已擴(kuò)大應(yīng)用于,。
②脂類物質(zhì)：可將其在有機(jī)溶劑（例如乙醇）中溶解后加入ELISA板孔中，開蓋置冰箱過夜或冷風(fēng)吹干,，待酒精揮發(fā)后,，讓脂質(zhì)自然干固在固相表面。
③小分子必須依靠和大的蛋白載體偶聯(lián)后才能固定在固相載體上,。
二,、包被液的選擇
一般選擇ph9.6的碳酸鹽緩沖液。但有時(shí)由于實(shí)驗(yàn)的需要,，包被原的特殊性也可能采用中性的緩沖溶液來包,。
應(yīng)注意以下原理：ELISA試劑盒由于蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結(jié)合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團(tuán)與固相載體表面的疏水基團(tuán)間的作用,，這種物理吸附是非特異性的,，受蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn),、濃度等的影響,，大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團(tuán)，故更易吸附到固相載體表面,。具體的實(shí)驗(yàn)還要有堅(jiān)固的理論外也要實(shí)踐,，看一下zui終可不可以應(yīng)用到自己實(shí)驗(yàn)當(dāng)中去。常用的包被液除了剛才提到的pH9.6碳酸鹽緩沖液,，還有pH7.2的磷酸鹽緩沖液和pH7-8的Tris-HCL緩沖液等等,。
三、封閉
繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程,。封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙,，從而排斥ELISA后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。常用封閉劑有：0.05%-0.5%的BSA,；10%的小牛血清或1%明膠,；脫脂奶粉，比較價(jià)廉,，可以高濃度使用（5%－10％）,；還有一些稀有用到的各種動(dòng)物血清 （主要為了排除相似蛋白干擾）和酪蛋白等等。但zui終選用什么,，要依據(jù)實(shí)驗(yàn)具體來實(shí)踐,。
四,、洗滌板
可以說在ELISA試劑盒操作中，洗滌是zui主要的關(guān)鍵技術(shù),。因?yàn)榫郾揭蚁┑人芰蠈Φ鞍踪|(zhì)的吸附是普遍性的,，為達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的，清除殘留在板孔中游離的物質(zhì),，以及非特異性地吸附的干擾物質(zhì),，在洗滌時(shí)又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來。所以在洗板時(shí)會有一定誤差,，人為因素很大（當(dāng)然有條件的用洗板機(jī)除外）,，洗的不*或串了孔，對如此靈敏的ELISA試劑盒系統(tǒng)可是不小的影響,。
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