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小細(xì)胞之大奧妙
閱讀：2243 發(fā)布時(shí)間：2019-5-7有經(jīng)驗(yàn)和剛剛從事細(xì)胞培養(yǎng)工作的人員都應(yīng)該認(rèn)真仔細(xì)地詢問下細(xì)胞提供方提供的建議,，提前了解所要培養(yǎng)細(xì)胞的詳細(xì)資料,，準(zhǔn)備好細(xì)胞所要用到的培養(yǎng)基和相關(guān)試劑,，雖然所有的貼壁,，半貼壁或者懸浮細(xì)胞處理方式差不多,，但是不同的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件和處理力度還有試劑的批間差這些問題存在,，也會(huì)導(dǎo)致對(duì)細(xì)胞處理不當(dāng)，或者環(huán)境的不適應(yīng)而造成細(xì)胞的死亡,。
1.收到細(xì)胞,，時(shí)間要鏡檢：觀察細(xì)胞形態(tài)是否正常，對(duì)于貼壁細(xì)胞則要注意看貼壁情況是否很好,，觀察細(xì)胞密度,，有疑議及時(shí)咨提供細(xì)胞的技術(shù)人員。由于運(yùn)輸?shù)臅r(shí)間或者溫度的變化,，很多貼壁細(xì)胞在盛滿培養(yǎng)基的瓶子里生長的狀態(tài)和平時(shí)會(huì)有點(diǎn)不一樣,，主要是貼壁牢固問題。比如293T,，平時(shí)貼壁就不是很牢,，在裝滿的培養(yǎng)基瓶子里面，會(huì)發(fā)生大片的脫落,，細(xì)胞聚集在一起,，但是細(xì)胞生長還是正常的,，通過離心收集，加以胰酶的消化,，重新打散,，又可以正常的貼壁生長。
2.當(dāng)通過上一步的觀察,，細(xì)胞初步?jīng)]有任何問題時(shí),，進(jìn)行下一步操作。當(dāng)收到的細(xì)胞密達(dá)到80%左右時(shí),，則處理如下：棄除瓶中大部分培養(yǎng)基,，僅保留5到10mL培養(yǎng)所需的常規(guī)培養(yǎng)基；或更換新鮮的培養(yǎng)基,，置于培養(yǎng)箱中,，隨后每天觀察。細(xì)胞在低于正常生長溫度情況下,，會(huì)調(diào)整為靜止期,，或者慢速生長期，必須恢復(fù)37度的環(huán)境至少3個(gè)小時(shí)左右,，才能重新調(diào)整到接近對(duì)數(shù)生長期的狀態(tài),，在對(duì)數(shù)生長期進(jìn)行細(xì)胞的傳代會(huì)大大增加傳代的成功率，和細(xì)胞的存活率,。
3.如果經(jīng)步觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞密度超過90%,，并且細(xì)胞狀態(tài)很好時(shí)，則復(fù)溫后2個(gè)小時(shí)需要立即傳代,。傳代的比例應(yīng)依據(jù)不同的細(xì)胞而定,。對(duì)于生長比較快，狀態(tài)穩(wěn)定,，不易受外界影響的細(xì)胞可以一次多傳幾瓶；對(duì)于生長較慢,，細(xì)胞比較薄,，狀態(tài)容易波動(dòng)的細(xì)胞類型，一次少傳些,，保證每瓶細(xì)胞密度大些,，便于穩(wěn)定生長。至于一些比較陌生的細(xì)胞,，次處理也可以依照第二種情況,。
傳代操作：
1.吸除培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液。
2.加入無菌pbs洗液（5-8mL）輕輕潤濕細(xì)胞,，稀釋多余的培養(yǎng)基,，之后吸走洗液,，動(dòng)作要輕，不可吹打到細(xì)胞,。
3.向瓶內(nèi)加入含0.25%EDTA的胰蛋白酶混合液少許,，以能覆滿瓶底為限。
4.置溫箱中2~5分鐘,，一旦鏡檢發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)回縮,，細(xì)胞間隙增大后，細(xì)胞變圓,，比較松動(dòng)后,，立即終止消化。
5.加入該細(xì)胞對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基6mL（T25培養(yǎng)瓶）或12mL（T75培養(yǎng)瓶）終止消化,。
6.用吸管通過吸取的培養(yǎng)基輕輕反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞,，使之從瓶壁脫離形成細(xì)胞懸液。吹打時(shí)應(yīng)盡量以少的次數(shù)將細(xì)胞從壁上吹下,，不僅要控制吹打的力度,、次數(shù)，還要注意要將細(xì)胞盡可能吹成單個(gè),。這樣既能減少死細(xì)胞,，又能便于細(xì)胞再次均勻貼壁生長。
7.依據(jù)傳代比例,，將細(xì)胞懸液分瓶,，再補(bǔ)充培養(yǎng)基后，靜置于溫箱培養(yǎng),，直止貼壁,。
貼壁細(xì)胞在培養(yǎng)瓶長成致密單層后，繼續(xù)生長的空間不足,，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成份也消耗較多,，同時(shí)代謝廢物也有較多堆積，需要分瓶培養(yǎng),，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代擴(kuò)增,。對(duì)于貼壁不太緊的細(xì)胞如293，可以直接吹散后分瓶,。而對(duì)于貼壁較緊的細(xì)胞如CHO,，則需要以胰酶消化后再吹散分瓶。以筆者的經(jīng)驗(yàn),，以輕吹或加培養(yǎng)液后輕搖可下較好,，但對(duì)于經(jīng)驗(yàn)不太充分的實(shí)驗(yàn)者而言是較難判斷掌握的。
胰酶消化的程度是一個(gè)關(guān)鍵：消化過度則對(duì)細(xì)胞的活性影響較大,，并有部分細(xì)胞漂浮,，隨棄去的胰酶流失;消化不足則細(xì)胞難于從瓶壁上吹下,，反復(fù)吹打同樣也會(huì)損傷細(xì)胞活性。影響消化速度的因素較多,，主要有胰酶溶液的活性(配制條件,、凍存或4℃保存時(shí)間長短、是否反復(fù)凍融,、解凍后存放時(shí)間及溫度等),、消化時(shí)的溫度(氣溫、細(xì)胞培養(yǎng)瓶及胰酶溶液的溫度)以及所加胰酶溶液的多少等,。含有EDTA的胰酶會(huì)比不含的消化能力強(qiáng)很多,，不同細(xì)胞對(duì)消化液的敏感性也不同，比如HEP-G2人肝癌細(xì)胞,，該細(xì)胞消化時(shí)間可長達(dá)10分鐘左右,。 消化時(shí)間仔細(xì)去摸索一下，每過2分鐘鏡下觀察細(xì)胞是否變圓,，記錄*消化時(shí)間,，下一次操作參考之前的記錄來控制時(shí)間即可。
對(duì)于懸浮細(xì)胞換液時(shí)只需要補(bǔ)液就行,。
懸浮細(xì)胞的傳代則不需要用胰酶消化,，直接通過計(jì)數(shù)算好傳代的比例，直接分瓶,，補(bǔ)液,。有些懸浮細(xì)胞趨于成團(tuán)生長，此時(shí)細(xì)胞生長狀態(tài)良好,，當(dāng)補(bǔ)液時(shí),，避免吹打。典型實(shí)例：jurkat就是成團(tuán)生長,。當(dāng)jurkat細(xì)胞密度比較大時(shí),，可將培養(yǎng)瓶豎直放置2分鐘左右，待大部分細(xì)胞沉下,，吸走上層清液,，補(bǔ)充等量的新鮮培養(yǎng)基。