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恒遠(yuǎn)解說：ELISA試劑盒實驗時不為人知的小細(xì)節(jié)
閱讀：1622 發(fā)布時間：2017-5-24ELISA試劑盒實驗封閉很重要
封閉液的作用是讓不相關(guān)的蛋白占據(jù)微孔板中潛在的結(jié)合位點,。這就降低了可產(chǎn)生信號的抗體非特異結(jié)合的機(jī)會,。您當(dāng)然也希望抗體只與目的蛋白結(jié)合吧,。如果您的背景過高,，懷疑封閉不充分,，那么您可以嘗試使用更高濃度的封閉液,，或適當(dāng)延長封閉時間,。
如果您一直被背景問題所困擾,，那么也許您該花些時間來優(yōu)化封閉液,。這可能需要時間，但也是值得的,。目前主要有兩種類型的封閉液：蛋白和非離子型去污劑,。您使用的類型須取決于多個因素，包括微孔板的表面試劑,、吸附的抗原,、您的抗體和檢測試劑。好的封閉液應(yīng)降低非特異性結(jié)合,，但它不應(yīng)當(dāng)與抗原,、抗體或檢測試劑發(fā)生相互作用。
zui常用的非離子型去污劑是Tween-20,。這種封閉液便宜,、穩(wěn)定，在去除洗滌過程中的一些非特異結(jié)合上很有用,。但它們只在存在時起作用,，因為很容易被洗掉。因此所有洗滌液中也必須添加封閉液,。請勿使用高濃度（正常濃度為0.01-0.1%）,，它會降低特異結(jié)合，產(chǎn)生假陰性,。另一個選擇是使用蛋白和非離子型去污劑這兩種封閉液,，后者可協(xié)助洗滌過程中的封閉,。
蛋白封閉液則有所不同，是*的,。它們與開放位點結(jié)合并封閉，同時穩(wěn)定與微孔板結(jié)合的抗原分子,。常用的蛋白封閉液包括牛血清白蛋白（BSA）,、脫脂奶粉、正常血清和魚明膠,。血清組分的內(nèi)在多樣性可使它有效攔截許多不同類型的分子相互作用,。不過，它的缺點在于能與Protein A和IgG抗體相互作用,。解決這個問題的一種方法是使用雞或魚的正常血清,。
ELISA試劑盒抗體濃度須優(yōu)化
我們通常會follow師兄師姐留下來的操作步驟，但是如果試劑稍有不同,，則可能需要優(yōu)化抗體的量,。記住，非特異的抗體結(jié)合會增加背景,。為了防止這一點,，切勿使用過多的一抗或二抗。
檢測試劑要適量
另一點也很顯而易見：切勿使用過多的檢測試劑,。如果濃度過高,，或者未正確稀釋，則會導(dǎo)致高背景,。也不要顯色過度,，如有必要，優(yōu)化一下何時應(yīng)加入終止液,。
洗滌很關(guān)鍵
洗滌步驟看似很無聊,，其實很重要，因為如果未結(jié)合的材料（如非特異結(jié)合的抗體或檢測試劑）殘留在微孔板中,，那么它會增加背景噪音,。如有必要，可增加洗滌液中的鹽濃度,，這會阻止非特異結(jié)合反應(yīng),。如果ELISA試劑盒實驗背景過高，而您懷疑洗滌不夠時,，可以嘗試增加洗滌次數(shù),。