如何調(diào)整流動(dòng)相實(shí)現(xiàn)提升分離度與改善峰形

時(shí)間：2022/3/11閱讀：3071

昨天的分離度不太行呀,，流動(dòng)相要再調(diào)調(diào)！"這話是不是很熟悉,？調(diào)調(diào),？！咋調(diào),？如果你還不知道如何配制合適的流動(dòng)相瞅這里,！

秘訣1：由強(qiáng)到弱

一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或緩沖溶液)進(jìn)行試驗(yàn)，這樣可以很快地得到分離結(jié)果,，然后根據(jù)出峰情況調(diào)整有機(jī)溶劑(乙腈或甲醇)的比例,。

秘訣2：三倍規(guī)則

每減少10%的有機(jī)溶劑(甲醇或乙腈)的量，保留因子約增加3倍,，此為三倍規(guī)則,。這是一個(gè)聰明而又省力的辦法。調(diào)整的過程中,，注意觀察各個(gè)峰的分離情況,。

秘訣3：粗調(diào)轉(zhuǎn)微調(diào)

當(dāng)分離達(dá)到一定程度，應(yīng)將有機(jī)溶劑10%的改變量調(diào)整為5%,，并據(jù)此規(guī)則逐漸降低調(diào)整率,，直至各組分的分離情況不再改變。

1．流動(dòng)相的性質(zhì)要求一個(gè)理想的液相色譜流動(dòng)相溶劑應(yīng)具有低粘度,、與檢測(cè)器兼容性好,、易于得到純品和低毒性等特征。

選擇流動(dòng)相時(shí)應(yīng)考慮以下幾個(gè)方面：

①流動(dòng)相應(yīng)不改變填料的任何性質(zhì),。低交聯(lián)度的離子交換樹脂和排阻色譜填料有時(shí)遇到某些有機(jī)相會(huì)溶脹或收縮,，從而改變色譜柱填床的性質(zhì)。堿性流動(dòng)相不能用于硅膠柱系統(tǒng),。酸性流動(dòng)相不能用于氧化鋁,、氧化鎂等吸附劑的柱系統(tǒng)。

②純度,。色譜柱的壽命與大量流動(dòng)相通過有關(guān),，特別是當(dāng)溶劑所含雜質(zhì)在柱上積累時(shí)。

③必須與檢測(cè)器匹配。使用UV檢測(cè)器時(shí),，所用流動(dòng)相在檢測(cè)波長(zhǎng)下應(yīng)沒有吸收,，或吸收很小。當(dāng)使用示差折光檢測(cè)器時(shí),，應(yīng)選擇折光系數(shù)與樣品差別較大的溶劑作流動(dòng)相,，以提高靈敏度。

④粘度要低（應(yīng)<2cp）,。高粘度溶劑會(huì)影響溶質(zhì)的擴(kuò)散,、傳質(zhì),，降低柱效,，還會(huì)使柱壓降增加，使分離時(shí)間延長(zhǎng),。最好選擇沸點(diǎn)在100℃以下的流動(dòng)相,。

⑤對(duì)樣品的溶解度要適宜。如果溶解度欠佳,，樣品會(huì)在柱頭沉淀,，不但影響了純化分離，且會(huì)使柱子惡化,。

⑥樣品易于回收,。應(yīng)選用揮發(fā)性溶劑。

2．流動(dòng)相的pH值

采用反相色譜法分離弱酸（3≤pKa≤7）或弱堿（7≤pKa≤8）樣品時(shí),，通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值,，以抑制樣品組分的解離，增加組分在固定相上的保留,，并改善峰形的技術(shù)稱為反相離子抑制技術(shù),。對(duì)于弱酸，流動(dòng)相的pH值越小,，組分的k值越大,，當(dāng)pH值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于弱酸的pKa值時(shí)，弱酸主要以分子形式存在,；對(duì)弱堿,，情況相反。分析弱酸樣品時(shí),，通常在流動(dòng)相中加入少量弱酸,，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和1%醋酸溶液；分析弱堿樣品時(shí),，通常在流動(dòng)相中加入少量弱堿,，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和30mmol/L三乙胺溶液。

注：流動(dòng)相中加入有機(jī)胺可以減弱堿性溶質(zhì)與殘余硅醇基的強(qiáng)相互作用,，減輕或消除峰拖尾現(xiàn)象,。所以在這種情況下有機(jī)胺（如三乙胺）又稱為減尾劑或除尾劑,。

(三乙胺triethylamine 氨分子中的氫原子被3個(gè)乙基取代的產(chǎn)物。分子式(CH₃CH₂)₃N,。易揮發(fā)的無色液體,，有氨的氣味。熔點(diǎn)－114.7℃,，沸點(diǎn)89.3℃,，相對(duì)密度0.7275（20／4℃）。溶于水和乙醇,、yi 迷等有機(jī)溶劑,。三乙胺有堿性，與無機(jī)酸能生成易溶于水的鹽類,?？捎蒒，N- 二乙基乙酰氨與氫化鋁鋰反應(yīng)制取,，也可用乙醇胺進(jìn)行氣相烷基化反應(yīng)合成,。用于制橡膠硫化促進(jìn)劑、潤(rùn)濕劑和殺菌劑等,，也可用作溶劑和用于合成四級(jí)銨化合物),。

3. 如何選擇緩沖液PH值在選擇緩沖液PH值之前，應(yīng)先了解被分析物的Pka,，高于或低于Pka兩個(gè)PH值單位的,，有助于獲得好的、尖銳的峰,，從HH公式：PH＝Pka＋log（[A-]/[A]）得知,，溶液PH值高于或低于Pka兩個(gè)單位，化合物中99％以一種形式存在,，而一種形式存在的化合物才能獲得好的尖銳的峰,。顯示的是它的離子形式和中性化合物的轉(zhuǎn)變，苯甲酸的Pka等于4.2,，理論上由HH公示得知,，當(dāng)溶液PH值等于2.2時(shí)，99％的苯甲酸以中性化合物存在,，PH值等于6.2時(shí)99%的苯甲酸以離子形式存在,，所以當(dāng)緩沖液PH值等于2.2時(shí)，中性化合物以羧酸形式保留于反相柱,，表1列出了一般緩沖液和他們的緩沖范圍,。從表1知磷酸鹽和檸檬酸鹽緩沖液能用于PH值等于2.2。

當(dāng)化合物只有氨基時(shí)，緩沖體系的選擇十分簡(jiǎn)單,，大多數(shù)氨基化合物在PH值小于9時(shí)都被質(zhì)子化,，所以所有PH值在7或更低的溶液均適合應(yīng)用，你也許會(huì)問水的PH值大約是7,，為什么還用緩沖鹽,，因?yàn)榫彌_鹽有助于增加方法的可靠性，以及色譜峰的尖銳性,，PH值的降低有助于氨基化合物保留的減弱,，減小化合物與硅膠表面硅羥基的作用，而使峰更尖銳,，從表1 可知,，任何緩沖液均可應(yīng)用于氨基化合物的分析，但我們認(rèn)為PH值等于3的磷酸鉀鹽適合用于氨基化合物的分析,。

在上面兩個(gè)例子中,，PH＝3的磷酸鉀鹽都能獲得良好的應(yīng)用,，在一般情況下,，它是含羧基和氨基化合物分析中好的緩沖液，并且我們認(rèn)為在氨基化合物分析中鉀鹽比鈉鹽更好,。

4．流動(dòng)相的脫氣

HPLC所用流動(dòng)相必須預(yù)先脫氣,，否則容易在系統(tǒng)內(nèi)逸出氣泡，影響泵的工作,。氣泡還會(huì)影響柱的分離效率,，影響檢測(cè)器的靈敏度、基線穩(wěn)定性,，甚至使無法檢測(cè),。（噪聲增大，基線不穩(wěn),，突然跳動(dòng)）,。此外，溶解在流動(dòng)相中的氧還可能與樣品,、流動(dòng)相甚至固定相（如烷基胺）反應(yīng),。溶解氣體還會(huì)引起溶劑pH的變化，對(duì)分離或分析結(jié)果帶來誤差,。溶解氧能與某些溶劑（如甲醇,、四氫呋喃）形成有紫外吸收的絡(luò)合物，此絡(luò)合物會(huì)提高背景吸收（特別是在260nm以下）,，并導(dǎo)致檢測(cè)靈敏度的輕微降低,，但更重要的是，會(huì)在梯度淋洗時(shí)造成基線漂移或形成鬼峰（假峰）。在熒光檢測(cè)中,，溶解氧在一定條件下還會(huì)引起淬滅現(xiàn)象,，特別是對(duì)芳香烴、脂肪醛,、酮等,。在某些情況下，熒光響應(yīng)可降低達(dá)95%,。在電化學(xué)檢測(cè)中（特別是還原電化學(xué)法）,，氧的影響更大。

除去流動(dòng)相中的溶解氧將大大提高UV檢測(cè)器的性能,，也將改善在一些熒光檢測(cè)應(yīng)用中的靈敏度,。常用的脫氣方法有：加熱煮沸、抽真空,、超聲,、吹氦等。

對(duì)混合溶劑,，若采用抽氣或煮沸法,，則需要考慮低沸點(diǎn)溶劑揮發(fā)造成的組成變化。

超聲脫氣比較好,，10~20分鐘的超聲處理對(duì)許多有機(jī)溶劑或有機(jī)溶劑/水混合液的脫氣是足夠了（一般500ml溶液需超聲20~30min方可）,，此法不影響溶劑組成。超聲時(shí)應(yīng)注意避免溶劑瓶與超聲槽底部或壁接觸,，以免玻璃瓶破裂,，容器內(nèi)液面不要高出水面太多。

離線（系統(tǒng)外）脫氣法不能維持溶劑的脫氣狀態(tài),，在你停止脫氣后,，氣體立即開始回到溶劑中。在1~4小時(shí)內(nèi),，溶劑又將被環(huán)境氣體所飽和,。

在線（系統(tǒng)內(nèi)）脫氣法無此缺點(diǎn)。常用的在線脫氣法為鼓泡,，即在色譜操作前和進(jìn)行時(shí),，將惰性氣體噴入溶劑中。嚴(yán)格來說,，此方法不能將溶劑脫氣,，它只是用一種低溶解度的惰性氣體（通常是氦）將空氣替換出來。此外還有在線脫氣機(jī),。

一般說來有機(jī)溶劑中的氣體易脫除,，而水溶液中的氣體較頑固,。在溶液中吹氦是相當(dāng)有效的脫氣方法，這種連續(xù)脫氣法在電化學(xué)檢測(cè)時(shí)經(jīng)常使用,。但氦氣昂貴,，難于普及。

5．流動(dòng)相的濾過所有溶劑使用前都必須經(jīng)0.45µm（或0.22µm）濾過,，以除去雜質(zhì)微粒,，色譜純?cè)噭┮膊焕猓ǔ窃跇?biāo)簽上標(biāo)明“已濾過"）。用濾膜過濾時(shí),，特別要注意分清有機(jī)相（脂溶性）濾膜和水相（水溶性）濾膜,。有機(jī)相濾膜一般用于過濾有機(jī)溶劑，過濾水溶液時(shí)流速低或?yàn)V不動(dòng),。水相濾膜只能用于過濾水溶液,，嚴(yán)禁用于有機(jī)溶劑，否則濾膜會(huì)被溶解,！溶有濾膜的溶劑不得用于HPLC,。對(duì)于混合流動(dòng)相，可在混合前分別濾過,，如需混合后濾過,，選用有機(jī)相濾膜。現(xiàn)在已有混合型濾膜出售,。流動(dòng)相的貯存流動(dòng)相一般貯存于玻璃,、聚四氟乙烯或不銹鋼容器內(nèi)，不能貯存在塑料容器中,。因許多有機(jī)溶劑如甲醇、乙酸等可浸出塑料表面的增塑劑,，導(dǎo)致溶劑受污染,。這種被污染的溶劑如用于HPLC系統(tǒng)，可能造成柱效降低,。貯存容器一定要蓋嚴(yán),，防止溶劑揮發(fā)引起組成變化，也防止氧和二氧化碳溶入流動(dòng)相,。

磷酸鹽,、乙酸鹽緩沖液很易長(zhǎng)霉，應(yīng)盡量新鮮配制使用,，不要貯存,。如確需貯存，可在冰箱內(nèi)冷藏,，并在3天內(nèi)使用,，用前應(yīng)重新濾過,。容器應(yīng)定期清洗，特別是盛水,、緩沖液和混合溶液的瓶子,，以除去底部的雜質(zhì)沉淀和可能生長(zhǎng)的微生物。因甲醇有防腐作用,，所以盛甲醇的瓶子無此現(xiàn)象,。

6．鹵代有機(jī)溶劑應(yīng)特別注意的問題鹵代溶劑可能含有微量的酸性雜質(zhì)，能與HPLC系統(tǒng)中的不銹鋼反應(yīng),。鹵代溶劑與水的混合物比較容易分解,，不能存放太久。鹵代溶劑（如CCl4,、CHCl3等）與各種醚類（如yi迷,、二異丙醚、四氫呋喃等）混合后,，可能會(huì)反應(yīng)生成一些對(duì)不銹鋼有較大腐蝕性的產(chǎn)物,，這種混合流動(dòng)相應(yīng)盡量不采用，或新鮮配制,。此外,，鹵代溶劑（如CH2Cl2）與一些反應(yīng)性有機(jī)溶劑（如乙腈）混合靜置時(shí)，還會(huì)產(chǎn)生結(jié)晶,?？傊u代溶劑最好新鮮配制使用,。如果是和干燥的飽和烷烴混合,，則不會(huì)產(chǎn)生類似問題。

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