色譜又稱(chēng)色層法或?qū)游龇?，是一種物理化學(xué)分析方法，它利用不同溶質(zhì)(樣品)與固定相和流動(dòng)相之間的作用力(分配,、吸附,、離子交換等)的差別，當(dāng)兩相做相對(duì)移動(dòng)時(shí),，各溶質(zhì)在兩相間進(jìn)行多次平衡,，使各溶質(zhì)達(dá)到相互分離。

01柱色譜

為向玻璃管中填入固定相,，以流動(dòng)相溶劑浸潤(rùn)后在上方倒入待分離的溶液，再滴加流動(dòng)相,，因?yàn)榇蛛x物質(zhì)對(duì)固定相的吸附力不同,，吸附力大的固著不動(dòng)或移動(dòng)緩慢，吸附力小的被流動(dòng)相溶劑洗下來(lái)隨流動(dòng)相向下流動(dòng),，從而實(shí)現(xiàn)分離,。

02紙色譜

以濾紙條為固定相，在紙條上點(diǎn)上待分離的混合溶液的樣點(diǎn),，將紙條下端浸入流動(dòng)相溶劑中懸掛,，溶劑因?yàn)槊?xì)作用沿濾紙條上升，樣點(diǎn)中的溶質(zhì)從而被分離,。

03薄層色譜
 

是在玻璃板上涂以固定相涂層,，然后點(diǎn)樣，下端浸入溶劑,，同樣自下而上分離,。常用于探索柱色譜實(shí)驗(yàn)條件，溶劑和固定相的選擇等,。

常用固定相有石膏,、氧化鋁、蔗糖,、淀粉等,，常用流動(dòng)相為水、苯等各種有機(jī)溶劑,。

影響色譜柱使用壽命的主要因素
　　

流動(dòng)相因素

1.流動(dòng)相pH
 

不同基質(zhì)的填料具有不同的pH適用范圍,。常溫下無(wú)定形硅膠在純水中的溶解度約為100mg·L-1，且在pH1～9的范圍內(nèi)溶解的硅膠量幾乎是常量,，考慮到溶解速度的影響,對(duì)于硅膠基質(zhì)的填料,其所能承受的流動(dòng)相pH范圍約為1～8,。

鍵合相硅膠填料則由于鍵合層的屏蔽作用,使填料對(duì)流動(dòng)相的適應(yīng)范圍大大增加，如現(xiàn)在廣泛使用的反相色譜填料C18(十八烷基硅烷鍵合硅膠),，其pH適用范圍可達(dá)2～10,。當(dāng)流動(dòng)相pH值超出酸性范圍時(shí),，鍵合相易發(fā)生水解而流失；當(dāng)流動(dòng)相pH超出堿性范圍時(shí),，會(huì)加速硅膠的溶解而釋放出絮狀物堵塞柱子,，這兩種反應(yīng)均是不可逆反應(yīng)，特別是在溫度較高（>40℃）的環(huán)境下,，會(huì)使柱效迅速降低而報(bào)廢,。

2.流動(dòng)相變質(zhì)

當(dāng)前使用的是硅基鍵合相填料，當(dāng)以水溶液作為流動(dòng)相或流動(dòng)相中含有一定濃度的磷酸鹽緩沖液時(shí),，水溶液中或緩沖鹽溶液中會(huì)滋生出一些細(xì)菌或霉菌,，從而堵塞固定相顆粒間的空隙。特別是對(duì)于多元自動(dòng)比例混合的液相色譜儀來(lái)說(shuō),水相或緩沖鹽相獨(dú)立存貯,，因存放時(shí)間較長(zhǎng)而容易發(fā)生此類(lèi)問(wèn)題,。

3.流動(dòng)相純度

目前，廣泛使用的填料顆粒粒徑范圍在3～10μm,孔徑在6～10nm,色譜柱在使用中會(huì)有大量的流動(dòng)相通過(guò),如流動(dòng)相含有微量不溶性雜質(zhì)顆粒,則很容易在柱頭部位被截留,久而久之,造成色譜柱機(jī)械性堵塞,引起柱壓升高而無(wú)法正常使用,。

4.其它因素

如,，流動(dòng)相的極性對(duì)柱子也有一定影響，甲醇,、水,、冰醋酸等極性較大的物質(zhì)會(huì)破壞硅膠填料柱，正丁醇,、二氯甲烷等極性小的物質(zhì)會(huì)破壞化學(xué)鍵合硅膠柱,，堿性溶液會(huì)破壞陽(yáng)離子交換樹(shù)脂色譜柱,酸性溶液容易損壞陰離子交換樹(shù)脂柱。

樣品因素

1.樣品的溶解性

樣品試樣在配制中,，如有少量微粒未能*溶解,，則會(huì)隨試樣一起進(jìn)入色譜柱，同樣,，會(huì)沉積在柱頭處,，造成色譜柱的堵塞。

2.樣品的純度
 

樣品中可能含有待分析組分以外的各種組分或雜質(zhì),，這些組分或雜質(zhì)可能會(huì)在柱內(nèi)產(chǎn)生不可逆吸附,，從而，使固定相的活性點(diǎn)被覆蓋,，保留特性發(fā)生變化,。

3.樣品的化學(xué)性質(zhì)

待測(cè)試樣中的各種組分與填料之間應(yīng)具有化學(xué)穩(wěn)定性，比較典型的是在使用氨基鍵合柱時(shí),，應(yīng)避免使用含羰基的化合物和流動(dòng)相,，如，丙酮、乙酸乙酯等,，以免固定相中的NH2和酐,、酮發(fā)發(fā)希夫(Schiff)縮合而使固定相破壞。

其它因素

影響色譜柱壽命的因素很多,，除流動(dòng)相和樣品因素外,，還有其它一些外在因素，如,，柱壓的影響,，溫度的影響，色譜柱的正確沖洗,，色譜柱的正確安裝等,。

色譜柱出現(xiàn)問(wèn)題的解決辦法

色譜柱在使用中zui常見(jiàn)的問(wèn)題就是柱壓升高，如果柱壓是在長(zhǎng)時(shí)間使用過(guò)程中緩慢增加,，屬于正?，F(xiàn)象。但柱壓在使用過(guò)程中突然升高（系統(tǒng)管路堵塞及壓力傳感器故障除外）,，以下列舉了部分常見(jiàn)原因及解決辦法：

1.色譜柱頭的過(guò)濾篩板堵塞或污染。

解決方法：如確定是色譜柱頭的過(guò)濾篩板被污染,，可以將色譜柱反方向用甲醇沖洗至正常壓力,，或者卸下色譜柱頭，將其放在10％的稀硝酸內(nèi)超聲清洗10分鐘,，后再用純水超聲10分鐘,，重新裝入色譜柱。

2.色譜柱頭的填料被樣品污染,。

解決方法：如確定色譜柱頭的填料被污染,，將柱頭螺絲卸下，挖出柱內(nèi)前段被污染的填料,，用相同的柱填料重新填入,，仔細(xì)修復(fù)后，重新安裝上柱頭螺絲,。

3.色譜柱內(nèi)緩沖液中的鹽遇到高濃度的甲醇或其他有機(jī)溶劑,，形成結(jié)晶析出。

解決方法：如確定定是鹽結(jié)晶,，用10%的甲醇/水沖洗色譜柱使柱內(nèi)鹽全部溶解,，再換高濃度甲醇。

4.流動(dòng)相PH值過(guò)大或過(guò)小使固定相結(jié)構(gòu)破壞或溶解,。

解決方法：如果因pH值使用不當(dāng),，很難恢復(fù)。

色譜柱的八大注意事項(xiàng)

1.避免壓力和溫度的急劇變化及任何機(jī)械震動(dòng)。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會(huì)影響柱內(nèi)的填充狀況,；柱壓的突然升高或降低也會(huì)沖動(dòng)柱內(nèi)填料,，因此，在調(diào)節(jié)流速時(shí)應(yīng)該緩慢進(jìn)行,，在閥進(jìn)樣時(shí)閥的轉(zhuǎn)動(dòng)不能過(guò)緩,。

2.應(yīng)逐漸改變?nèi)軇┑慕M成，特別是反相色譜中,，不應(yīng)直接從有機(jī)溶劑改變?yōu)槿渴撬?，反之亦然?br />
3.一般說(shuō)來(lái)色譜柱不能反沖，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時(shí),，才可以反沖除去留在柱頭的雜質(zhì),。否則反沖會(huì)迅速降低柱效。

4.選擇使用適宜的流動(dòng)相(尤其是pH),，以避免固定相被破壞,。有時(shí)可以在進(jìn)樣器前面連接一預(yù)柱，分析柱是鍵合硅膠時(shí),，預(yù)柱為硅膠,，可使流動(dòng)相在進(jìn)入分析柱之前預(yù)先被硅膠“飽和”，避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解,。

5.經(jīng)常用強(qiáng)溶劑沖洗色譜柱,，清除保留在柱內(nèi)的雜質(zhì)。在進(jìn)行清洗時(shí),，對(duì)流路系統(tǒng)中流動(dòng)相的置換應(yīng)以相混溶的溶劑逐漸過(guò)渡,，每種流動(dòng)相的體積應(yīng)是柱體積的20倍左右。

6.保存色譜柱時(shí)應(yīng)將柱內(nèi)充滿(mǎn)乙腈或甲醇,，柱接頭要擰緊,，防止溶劑揮發(fā)干燥。禁止將緩沖溶液留在柱內(nèi)靜置過(guò)夜或更長(zhǎng)時(shí)間,。

7.色譜柱使用過(guò)程中,，如果壓力升高，一種可能是燒結(jié)濾片被堵塞,，這時(shí)應(yīng)更換濾片或?qū)⑵淙〕鲞M(jìn)行清洗,；另一種可能是大分子進(jìn)入柱內(nèi)，使柱頭被污染,；如果柱效降低或色譜峰變形,，則可能柱頭出現(xiàn)塌陷，死體積增大,。在后兩種情況發(fā)生時(shí),，小心擰開(kāi)柱接頭，用潔凈小鋼將柱頭填料取出1～2mm高度(注意把被污染填料取凈)再把柱內(nèi)填料整平。然后用適當(dāng)溶劑濕潤(rùn)的固定相(與柱內(nèi)相同)填滿(mǎn)色譜柱,，壓平,，再擰緊柱接頭。這樣處理后柱效能得到改善,，但是很難恢復(fù)到新柱的水平,。

柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前裝一根與分析柱相同固定相的短柱(5～30mm),，可以起到保護(hù),、延長(zhǎng)柱壽命的作用。采用保護(hù)柱會(huì)損失一定的柱效,，這是值得的,。通常色譜柱壽命在正確使用時(shí)可達(dá)2年以上。以硅膠為基質(zhì)的填料,，只能在pH=2～9范圍內(nèi)使用,。柱子使用一段時(shí)間后，可能有一些吸附作用強(qiáng)的物質(zhì)保留于柱頂,，特別是一些有色物質(zhì)更易看清被吸著在柱頂?shù)奶盍仙稀?br />
8.新的色譜柱在使用一段時(shí)間后柱頂填料可能塌陷,，使柱效下降，這時(shí)也可補(bǔ)加填料使柱效恢復(fù),。每次工作完后,，用洗脫能力強(qiáng)的洗脫液沖洗，例如,，ODS柱宜用甲醇沖洗至基線(xiàn)平衡。當(dāng)采用鹽緩沖溶液作流動(dòng)相時(shí),，使用完后應(yīng)用無(wú)鹽流動(dòng)相沖洗,。含鹵族元素(氟、氯,、溴)的化合物可能會(huì)腐蝕不銹鋼管道,，不宜長(zhǎng)期與之接觸。裝在HPLC儀上柱子如不經(jīng)常使用,，應(yīng)每隔4～5天開(kāi)機(jī)沖洗15分鐘,。

色譜柱不使用時(shí)應(yīng)該怎樣保存？

如果色譜柱不使用,，又該如何進(jìn)行保存呢,？下列方法可供參考：

在柱二端包起來(lái)，放到盒子里室溫避光保存,。毛細(xì)管柱可以用廢舊的隔墊裁成二塊,，分別插在毛細(xì)管二段。填充柱用小塑料袋套住，再用細(xì)金屬絲扎起來(lái),。因?yàn)榉治鍪矣性S多化學(xué)試劑,，特別在櫥內(nèi)會(huì)有些氣味，這樣能較好保管色譜柱,。放置時(shí)也要有序放置,，毛細(xì)管柱還是用盒子裝好以免壓壞，在放置時(shí)在柱上和記錄本上都做好記錄,。

拆下后,，兩頭用橡膠墊密封，橡膠墊原本色譜盒子就帶有,，如果沒(méi)有,，用進(jìn)樣墊制作一下就可以了，然后裝在原來(lái)的色譜盒子里面,，備注上相應(yīng)的信息,。通常要求放在干燥的地方，下次使用時(shí),，切記進(jìn)樣端和出口端不能裝反,。

液相色譜柱的正確使用

1.加裝保護(hù)柱

保護(hù)柱的作用是過(guò)濾掉來(lái)自流動(dòng)相和樣品的化學(xué)“拉圾”同時(shí)也可以有效除去流動(dòng)相和樣品中的不溶物。盡管現(xiàn)在的色譜儀在流動(dòng)相吸入口,、進(jìn)樣閥后部以及在色譜柱的兩端都裝有1,、2μm等不同孔徑的濾器,但濾器只能除去不溶性顆粒而不能除去化學(xué)污然,因此,加裝保護(hù)柱是必要的,特別是在分析中藥、中成藥等復(fù)雜混合物和生物樣品時(shí)更是保護(hù)分析柱*的措施,。

保護(hù)柱填料應(yīng)與分析柱一致,粒徑可較分析柱大,。保護(hù)柱屬消耗品,經(jīng)過(guò)一定次數(shù)的樣品分析(50～100次)后,出現(xiàn)柱壓顯著升高或峰形變壞或基線(xiàn)漂移時(shí),應(yīng)考慮更換保護(hù)柱。

2.過(guò)濾流動(dòng)相和樣品

流動(dòng)相通常由水或緩沖溶液與有機(jī)溶劑混合而成,原則上,所有經(jīng)過(guò)色譜柱的流動(dòng)相均應(yīng)過(guò)濾,但在實(shí)際操作上應(yīng)視具體情況而有所區(qū)別:當(dāng)有機(jī)溶劑用色譜純級(jí),水用石英亞沸水或其它超純水時(shí),在能確保水和有機(jī)溶劑的質(zhì)量且沒(méi)有受到污染時(shí),過(guò)濾并無(wú)更多實(shí)際意義,。

當(dāng)流動(dòng)相中含有緩沖鹽時(shí),則過(guò)濾是必要的,如前所述,當(dāng)緩沖溶液放置一段時(shí)間(視環(huán)境溫度不同而異,夏季一般不超過(guò)48h,冬季一般不超過(guò)一周)后,在使用前還應(yīng)重新過(guò)濾,。

所配制的樣品試液在注入流路系統(tǒng)前均要經(jīng)0.45μm（0.22μm則更好)孔徑濾膜過(guò)濾。要注意區(qū)分水系和油系,二者不可混用,以防止濾膜溶解而造成污染,。裝流動(dòng)相的容器和色譜系統(tǒng)中的在線(xiàn)濾器要定期清洗和更換,以避免濾器因過(guò)載而起不到過(guò)濾作用,。

3.凈化樣品

當(dāng)樣品中含有對(duì)色譜柱有損害的化學(xué)成分,如產(chǎn)生yongjiu性吸附的蛋白質(zhì)、糖等有機(jī)分子和強(qiáng)吸附性物質(zhì),以及可能對(duì)柱填料產(chǎn)生破壞作用的基團(tuán)離子,。在進(jìn)樣前應(yīng)盡可能對(duì)樣品進(jìn)行分離提純以除去多余雜質(zhì)組分,。

4.避免過(guò)高的柱壓

雖然液相色譜柱能耐受的壓力可達(dá)6000psi(磅/平方英寸),但過(guò)高及過(guò)大的壓力變化均會(huì)縮短色譜柱的壽命,避免的方法是：

(1)柱壓過(guò)高時(shí),盡可能采用較小的流速,以不超過(guò)柱zui大允許壓力的一半為宜。

(2)當(dāng)流速較大時(shí),應(yīng)采取流速梯度的辦法使流速分步到位,。

(3)使用手動(dòng)進(jìn)樣閥時(shí),進(jìn)樣閥的切換要盡可能的快,。否則超過(guò)20%的壓力沖擊會(huì)很快使柱報(bào)廢。當(dāng)使用多柱聯(lián)用時(shí),柱切換要避免在高壓下進(jìn)行,。

5.注意溫度和酸堿度

一般以硅膠為基質(zhì)的色譜柱zui高使用溫度不超過(guò)60℃,，以低于40℃為宜,，特別是在流動(dòng)相pH接近使用限度時(shí)，更應(yīng)降低使用溫度,。溫度過(guò)高會(huì)加快鍵合相的水解和硅膠的溶解,，從而，使填料性質(zhì)改變,，柱床塌陷,，降低柱效，改變峰形,。目前的鍵合硅膠色譜柱標(biāo)示的pH適用范圍可達(dá)2～10,但在實(shí)際使用時(shí)應(yīng)避免的pH條件,特別是在偏堿性的條件(pH≥8)下使用,如必須要在的pH條件下使用時(shí),可通過(guò)以下方法避免柱損害：

（1）在泵和進(jìn)樣閥之間加裝預(yù)柱(飽和柱)來(lái)飽和流動(dòng)相,；

（2）降低使用溫度；

（3）檢驗(yàn)完畢后立即用與所使用的流動(dòng)相互相混溶的“溫和溶劑”*清洗,；

6.正確及時(shí)的沖洗

開(kāi)始試驗(yàn)前,應(yīng)了解柱中當(dāng)前是何種溶劑,。對(duì)于新色譜柱,如無(wú)特殊說(shuō)明均為評(píng)價(jià)報(bào)告中所用流動(dòng)相。柱中當(dāng)前溶劑一定要與分析樣品所用流動(dòng)相互溶,如不能混溶,要用與二者均能相互混溶的第三種溶劑過(guò)渡,。異丙醇是能與各種溶劑混溶的試劑,可作為中介流動(dòng)相使用,。

反相鍵合硅膠柱適宜的保存環(huán)境是純甲醇,如分析用流動(dòng)相為緩沖液有機(jī)溶劑,可先用較低甲醇含量(<20%)的甲醇置換掉原來(lái)的純甲醇,再進(jìn)分析用流動(dòng)相，以防止在柱內(nèi)發(fā)生鹽的沉淀,；試驗(yàn)結(jié)束后,要及時(shí)用適當(dāng)?shù)娜軇_洗系統(tǒng)并zui終過(guò)渡到純甲醇沖洗,對(duì)于含有緩沖鹽的流動(dòng)相,，的辦法是先用與分析用流動(dòng)相組成*相同但不含緩沖鹽的溶液進(jìn)行沖洗，再逐步過(guò)渡到純甲醇沖洗,。

多數(shù)沖洗液體積大約為柱容積的15～20倍,但zui終要以基線(xiàn)是否平直,、壓力是否穩(wěn)定決定。有些廠家的色譜柱標(biāo)明了流動(dòng)相中有機(jī)相的zui低使用濃度為≥5%,使用時(shí)應(yīng)給予注意,。