細(xì)胞凋亡PI染色試劑盒
(Cell Apoptosis PI Detection Kit)
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一、試劑盒說明
熒光標(biāo)記是研究細(xì)胞凋亡的zui基本方法。細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化及生化學(xué)變化都可以通過熒光標(biāo)記的的方法而檢測出來,,從而區(qū)別鑒別出正常細(xì)胞,、凋亡細(xì)胞、壞死細(xì)胞以及不同凋亡時期或細(xì)胞周期,。
碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)是一種DNA結(jié)合性染料,其激發(fā)和發(fā)射波長分別為536nm和617nm,,產(chǎn)生紅色熒光,,但無膜通透性,不能透過活細(xì)胞膜,,只能染死細(xì)胞,。因此,在熒光顯微鏡下觀察,,正常細(xì)胞不能著色,,早期凋亡細(xì)胞呈微弱紅光,晚期凋亡細(xì)胞紅光加強,,壞死細(xì)胞呈強紅色熒光,。采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期時,凋亡細(xì)胞因內(nèi)源性核酸酶被激活,,使DNA廣泛降解,、斷裂,DNA結(jié)構(gòu)發(fā)生劇變,,隨著凋亡的進程,,DNA斷裂產(chǎn)生的小分子量DNA溢出胞外,細(xì)胞總DNA量降低,,于正常G0/G1細(xì)胞群前出現(xiàn)一DNA低染細(xì)胞群,,即G1峰前出現(xiàn)亞二倍體峰(sub-G1)或稱A0細(xì)胞群,即凋亡細(xì)胞群,。用本試劑盒的PI直接對細(xì)胞DNA染色后,,進行流式細(xì)胞儀分析,即可檢測到凋亡細(xì)胞DNA的變化,。
二,、試劑盒組份
組分 | KGA214(100 assays) | 儲存條件 |
Propidium Iodide, PI染液 | 500μL | 4℃,避光 |
10×Buffer A | 10 mL | 4℃ |
注: 1×Buffer A配制:用前用雙蒸水將10×Buffer A稀釋10倍,。
三,、試劑盒儀器和試劑
熒光顯微鏡、低速離心機,、微量移液器,、1.5m L Microtube、載玻片,、蓋玻片,、
流式細(xì)胞儀,、70%乙醇、RNase A
四,、用注意事項
Propidium Iodide (PI)有毒,,操作時要戴手套,需避光,。
五,、操作方法
1.熒光顯微鏡觀察
(1)收集細(xì)胞,1×Buffer A洗滌細(xì)胞一次(離心2000rpm,,5min),,加適量的
1×Buffer A重懸細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度約為106/mL,;
(2)取95ul細(xì)胞懸液,,加入5 μL PI染液,輕輕混勻,;
(3)室溫避光放置5 min后,,滴加于載玻片上,加蓋玻片,;
(4)熒光顯微鏡,,激發(fā)和發(fā)射波長分別為536nm和617nm,綠光*BG12濾光鏡觀察,,拍照,。
2.流式細(xì)胞儀分析
(1)用1×Buffer A洗滌細(xì)胞一次(離心2000rpm,5min),,收集并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL,;
(2)細(xì)胞加9倍體積的70%乙醇,于-20℃固定至少12小時;
(3) 離心收集細(xì)胞后,,用1×Buffer A洗細(xì)胞除去乙醇,細(xì)胞重懸于500 μLBuffer A中,;
(4)加入RNase A(用戶自備),使其終濃度為0.25mg/ml, 37℃,反應(yīng)30min,;
(5)加入5μLPI室溫避光染色30分鐘,;
(6)流式細(xì)胞儀或熒光光度計激發(fā)波長488nm檢測。