實驗材料:植物葉片 1.實驗步驟
一,、 取材料（約1g ，根據(jù)具體情況而定）,，放入冰鎮(zhèn)的培養(yǎng)皿里，加入解離液（約1～2mL）,，用鋒利分刀片一次性快速切碎,，整個過程,，材料必須浸沒在解離液里。
二,、 吸取培養(yǎng)皿內(nèi)的解離液，用400目的濾布過濾到冰鎮(zhèn)的離心管中,，放置4℃的冰箱中孵育10分鐘,。
三,、 離心。轉(zhuǎn)速：1000轉(zhuǎn)/分,，溫度：4℃，時間：8分鐘,。
四、去上清,，使用BD cycletest plus DNA reagent kit中的B液作用10min,，C液染色10min,。
五,、上機檢測。 1.解離液：
Chopping Buffer（LB01）
成分 濃度 用量
Tris 15mM 363mg
Na2EDTA 2mM 148.9mg
精胺 0.5mM 20.2mg
KCl 80mM 1.193g
NaCl 20mM 233.8mg
Triton X-100 0.1% 200ul
二巰基乙醇 15mM 220ul
加去離子水 至200ml
PH7.5,，0.22um濾膜過濾，-20?C凍存,。 結(jié)果：
1.樣本：桉樹幼苗的幼嫩葉片（正常體細(xì)胞）
染液：BD cycletest plus DNA reagent kit
File analyzed: Data.002.fcs
Date analyzed: 31-Mar-2011
Model: 1DA0n_DSD
Analysis type: Automatic analysis
Ploidy Mode: First cycle is diploid
Diploid: 100.00 %
Dip G1: 71.49 % at 63.58
Dip G2: 11.61 % at 127.15
Dip S: 16.90 % G2/G1: 2.00
%CV: 5.23
Total S-Phase: 16.90 %
Total B.A.D.: 19.34 %
Debris: 42.60 %
Aggregates: 2.76 %
Modeled events: 6646
All cycle events: 3631
Cycle events per channel: 56
RCS: 2.674 2.樣本：蝴蝶蘭葉片（嵌合體）
染液：BD cycletest plus DNA reagent kit
分析與總結(jié)：
1. 實驗材料的選擇：以選取植物葉片為實驗材料*,。若實驗材料取自野外，為避免運輸過程中材料受到高溫的影響,，采摘后應(yīng)立即用濕濾紙包裹置于冰盒中。若不立即進(jìn)行實驗,，可將材料儲存于-70℃冰箱中保存數(shù)日。
2. 細(xì)胞核的獲取數(shù)量：建議獲取20,000—30,000個,，因為用modfit分析時,，擬合的細(xì)胞數(shù)至少是10,000個,，分析結(jié)果*，而植物葉片制備細(xì)胞核懸浮液時會產(chǎn)生大量的碎片,，會顯著降低擬合細(xì)胞的比例，故需提高獲取數(shù)量,。
3. 獲取模板的優(yōu)化：FSC Vs SSC 選取log放大,，以FL2為閾值,，有利于排除部分碎片，同時較小的細(xì)胞核也不會漏檢,，另外，再設(shè)置一個FL2 Vs SSC點圖,，有利于排除一些帶有色素的細(xì)胞器的干擾,。 |
1.研究背景
1.1原生質(zhì)體的概念
植物原生質(zhì)體是指去除細(xì)胞壁被質(zhì)膜所包圍的,、具有活力的細(xì)胞，其結(jié)構(gòu)包括細(xì)胞膜,、細(xì)胞質(zhì)(包括各種細(xì)胞器、細(xì)胞骨架系統(tǒng)及胞基質(zhì))和細(xì)胞核等部分,。原生質(zhì)體培養(yǎng)和植株再生技術(shù)具有使用范圍廣,、可行性強等優(yōu)點,，是植物生物工程的基礎(chǔ)。對植物原生質(zhì)體的研究,，可追溯到20世紀(jì)60年代,，英國植物學(xué)家Cocking用酶解方法降解細(xì)胞壁,，獲得了番茄根尖原生質(zhì)體，自此原生質(zhì)體的研究得到迅速發(fā)展,。近年來，由于原生質(zhì)體具有結(jié)構(gòu)簡單,、發(fā)育同步性好,、群體數(shù)量大,、DNA分子易于進(jìn)入細(xì)胞，易獲得純合性轉(zhuǎn)化子的特點,，及其培養(yǎng)技術(shù)與有關(guān)的細(xì)胞、分子和遺傳等學(xué)科的交叉滲透,，使植物原生質(zhì)體的研究越來越受到重視,。研究領(lǐng)域也從分離原生質(zhì)體進(jìn)行的生理生化和利用不同材料的原生質(zhì)體得到再生植株的階段轉(zhuǎn)到原生質(zhì)體的應(yīng)用(尤其是遺傳性狀改良)方面,。 1.2原生質(zhì)體的制備
原生質(zhì)體的分離方法有兩種：機械分離法和酶解分離法。機械分離法由于產(chǎn)量低,、方法繁瑣費力；以及對分生組織和液泡化程度不高的細(xì)胞不適用的特點,，現(xiàn)在已很少有人使用,。 酶解分離法為目前普遍采用的原生質(zhì)體分離方法。酶解是在25~28 ℃的恒溫,、黑暗或弱光下進(jìn)行,；酶解后經(jīng)過0.038 mm孔徑左右的鎳絲網(wǎng)過濾,，濾去消解不*的組織碎塊（導(dǎo)管、篩管等）和細(xì)胞團,。然后將濾液離心,，棄去上清液,，將離心下來的原生質(zhì)體重新懸浮在洗液(CPW)中，再次離心,，去上清液，重復(fù)3 次,。在倒置顯微鏡下檢查純化效果,，效果好，用原生質(zhì)體培養(yǎng)基離心,，效果不好，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的蔗糖離心,，使完整的原生質(zhì)體浮于液面,。 1.3原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化
1）生物介質(zhì)介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化。目前應(yīng)用的生物介質(zhì)主要是根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌,。它們轉(zhuǎn)化的原理分別是通過活化Ti 和Ri 質(zhì)粒的Vir 區(qū)基因，達(dá)到對T-DNA 轉(zhuǎn)移的目的,。2）細(xì)胞融合法,。PEG介導(dǎo)法由Davey 等首先建立,，主要原理是借助細(xì)胞融合劑誘導(dǎo)原生質(zhì)體攝取外源DNA。PEG法的融合率可達(dá)10%~15%,，無種屬特異性，幾乎可誘導(dǎo)任何原生質(zhì)體的融合。細(xì)胞電融合法利用細(xì)胞在相對電極之間的介電電泳,，誘導(dǎo)細(xì)胞按特定方向排列，通過電極間產(chǎn)生的較高場強的電脈沖使相互接觸的細(xì)胞發(fā)生電穿孔,，進(jìn)而發(fā)生電融合。3）激光微束穿刺法,。激光微束穿刺法就是利用直徑很小、能量很高的激光微束引起細(xì)胞膜可逆性穿孔,，從而使處于細(xì)胞周圍的外源DNA 隨之進(jìn)入細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因方法。激光微束穿刺法操作簡便,，對細(xì)胞的損傷小，可以準(zhǔn)確定位于被照射的細(xì)胞,，實驗重復(fù)性好,。4）電擊法是利用高壓電脈沖作用,，在原生質(zhì)體膜上“電擊穿孔”,，形成可逆的瞬間通道，從而促進(jìn)外源DNA的攝入,。 1.4原生質(zhì)體的應(yīng)用
由于原生質(zhì)體失去了細(xì)胞壁這一屏障，因而使其具有特殊的優(yōu)點,。原生質(zhì)體不僅可作為一個單細(xì)胞系統(tǒng)來研究細(xì)胞壁再生、細(xì)胞分裂與分化,、攝入細(xì)胞器,、病毒侵染機理,、膜透性及離子轉(zhuǎn)運等基礎(chǔ)理論研究的理想材料；同時還是原生質(zhì)體培養(yǎng)和原生質(zhì)體融合的基礎(chǔ),。而且，近年來以原生質(zhì)體為材料利用膜片鉗技術(shù)研究離子通道及原生質(zhì)體在受光,、脅迫和激素作用后的調(diào)節(jié)機制已成為研究的熱點。此外,，原生質(zhì)體也被用來作為研究植物細(xì)胞鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及其調(diào)節(jié)機制的理想材料,。 |
3.實驗方法
3.1 分離原生質(zhì)體
前一天晚上
1. 使用約15 mL protoplast enzyme solution消化細(xì)胞壁,。
A. 選用生長1-3 周的植株 (請根據(jù)需要自行優(yōu)化條件) ,。
B. 23oC，孵育7-12小時,，溫和震蕩混勻。
*天,，上午
2. 用100 ?m濾網(wǎng)過濾收集細(xì)胞至標(biāo)記好的培養(yǎng)皿中,。
3. 在50 ml 管中加入等體積的21% 蔗糖溶液,。
4. 將第二步的細(xì)胞溶液加入第三步的蔗糖溶液中。
5. 梯度離心10 min,，750 rmp,。
6. 用藍(lán)槍頭從上層中吸取健康的完整的細(xì)胞。
7. 用等體積的W5溶液重懸細(xì)胞,。
8. 離心，500 rmp,，5min,。
9. 用W5溶液重懸細(xì)胞沉淀,。
10. 將細(xì)胞置于4 oC 保存直至使用。 |
3.2 PEG-介導(dǎo)轉(zhuǎn)化
*天,，下午
1. 準(zhǔn)備用于PEG轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體
A. 預(yù)冷新鮮制備的PEG溶液,。
B. 500 rpm,，1 min，離心原生質(zhì)體,。
C. 用MaMg 溶液重懸細(xì)胞至合適濃度: 106數(shù)量級, 至少300 ?l體積,。
D. 加DNA至一個新的14ml圓底管中– 所加DNA的量取決于表達(dá)水平。
E. 加300 ?l 細(xì)胞溶液至管中，溫和混勻,。
2. PEG轉(zhuǎn)化
A. 用等體積的PEG(300 ?l + DNA volume)和原生質(zhì)體 & DNA溶液(step E)混勻,，注意要非常溫和,。
B. 室溫孵育30 min。
3. 用W5溶液逐漸稀釋去除PEG
A. 700 ?l, 5 min -用剪掉末端的槍頭上下溫和吹打,。
B. 1 ml, 3 min; 2 ml – 每一步溫和的轉(zhuǎn)動管子,。
C. 離心，500 rpm,，5min，棄上清,。
4. 用1 ml W5 溶液重懸細(xì)胞沉淀。
5. (可選) 從未轉(zhuǎn)化的對照組中分離蛋白進(jìn)行Western檢測,。
6. 將細(xì)胞置23oC孵育 1-3 天,。 |
3.3 流式分選Protoplast
1. 對原生質(zhì)體進(jìn)行計數(shù),，調(diào)整原生質(zhì)體濃度為5*10^6/mL。
2. 使用BD FACSAriaIII流式細(xì)胞儀進(jìn)行分選,，收集GFP+原生質(zhì)體,。
A.打開準(zhǔn)備好的流式細(xì)胞分選儀，本實驗使用的是BD FACSAriaIII,。
B.儀器設(shè)置為：100µm噴嘴，20 psi鞘液壓力,。
C.細(xì)胞密度和樣本上樣速度可以根據(jù)特定需要加以調(diào)整——要高得率還是高速度,。
D.使用樣本混勻功能，防止在分選過程中原生質(zhì)體發(fā)生沉降,。
E.畫一張FSC/SSC散點圖,，調(diào)節(jié)電壓使細(xì)胞群體出現(xiàn)在散點圖的*,。
F.再畫一張GFP/PE-Texas Red散點圖，調(diào)節(jié)電壓,，使野生型對照原生質(zhì)體群體(non-GFP)
出現(xiàn)在散點圖的*,，GFP陽性原生質(zhì)體群體會在GFP熒光通道信號更強的位置現(xiàn)（在野生型對照樣本中沒有這個群體）。
G.如有必要,，調(diào)節(jié)補償，使GFP陰性和陽性原生質(zhì)體群體分得更開,。
H.設(shè)置門,，圈住GFP陽性群體。需要準(zhǔn)備一個non-GFP原生質(zhì)體陰性對照（Figure 1.）用以確定門的界限,。
I.根據(jù)實驗需要以及目的細(xì)胞的百分比，選擇合適的分選模式——高得率或者高純度,。
注：初始條件可選取100µm噴嘴,，20 psi鞘液壓力。后期根據(jù)樣本狀態(tài)的不同,，可以進(jìn)一步優(yōu)化分選條件,，包括：選擇更大的噴嘴尺寸，更低的鞘液壓力,，用戶自定義分選模式，優(yōu)化原生質(zhì)體培養(yǎng)緩沖液,，使用原生質(zhì)體培養(yǎng)緩沖液替代鞘液,，直接分選原生質(zhì)體到培養(yǎng)皿中等，都有助于保護分選后原生質(zhì)體的活性,。
3. 對分選后得到的GFP+原生質(zhì)體進(jìn)行離心，棄上清,。
4. 分選原生質(zhì)體后續(xù)實驗,，分析原生質(zhì)體基因組DNA，蛋白或代謝產(chǎn)物表達(dá)水平,。 |
