實(shí)驗(yàn)材料:植物葉片 1.實(shí)驗(yàn)步驟 一、 取材料(約1g ,,根據(jù)具體情況而定),,放入冰鎮(zhèn)的培養(yǎng)皿里,,加入解離液(約1~2mL),,用鋒利分刀片一次性快速切碎,,整個(gè)過程,材料必須浸沒在解離液里,。 二,、 吸取培養(yǎng)皿內(nèi)的解離液,用400目的濾布過濾到冰鎮(zhèn)的離心管中,,放置4℃的冰箱中孵育10分鐘,。 三,、 離心,。轉(zhuǎn)速:1000轉(zhuǎn)/分,溫度:4℃,時(shí)間:8分鐘,。 四,、去上清,使用BD cycletest plus DNA reagent kit中的B液作用10min,,C液染色10min,。 五、上機(jī)檢測(cè),。 1.解離液: Chopping Buffer(LB01) 成分 濃度 用量 Tris 15mM 363mg Na2EDTA 2mM 148.9mg 精胺 0.5mM 20.2mg KCl 80mM 1.193g NaCl 20mM 233.8mg Triton X-100 0.1% 200ul 二巰基乙醇 15mM 220ul 加去離子水 至200ml PH7.5,,0.22um濾膜過濾,-20?C凍存,。 結(jié)果: 1.樣本:桉樹幼苗的幼嫩葉片(正常體細(xì)胞) 染液:BD cycletest plus DNA reagent kit  File analyzed: Data.002.fcs Date analyzed: 31-Mar-2011 Model: 1DA0n_DSD Analysis type: Automatic analysis
Ploidy Mode: First cycle is diploid
Diploid: 100.00 % Dip G1: 71.49 % at 63.58 Dip G2: 11.61 % at 127.15 Dip S: 16.90 % G2/G1: 2.00 %CV: 5.23
Total S-Phase: 16.90 % Total B.A.D.: 19.34 %
Debris: 42.60 % Aggregates: 2.76 % Modeled events: 6646 All cycle events: 3631 Cycle events per channel: 56 RCS: 2.674 2.樣本:蝴蝶蘭葉片(嵌合體) 染液:BD cycletest plus DNA reagent kit 分析與總結(jié): 1. 實(shí)驗(yàn)材料的選擇:以選取植物葉片為實(shí)驗(yàn)材料*,。若實(shí)驗(yàn)材料取自野外,為避免運(yùn)輸過程中材料受到高溫的影響,,采摘后應(yīng)立即用濕濾紙包裹置于冰盒中,。若不立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn),可將材料儲(chǔ)存于-70℃冰箱中保存數(shù)日,。 2. 細(xì)胞核的獲取數(shù)量:建議獲取20,000—30,000個(gè),,因?yàn)橛胢odfit分析時(shí),擬合的細(xì)胞數(shù)至少是10,000個(gè),,分析結(jié)果*,,而植物葉片制備細(xì)胞核懸浮液時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量的碎片,會(huì)顯著降低擬合細(xì)胞的比例,,故需提高獲取數(shù)量,。 3. 獲取模板的優(yōu)化:FSC Vs SSC 選取log放大,以FL2為閾值,,有利于排除部分碎片,,同時(shí)較小的細(xì)胞核也不會(huì)漏檢,另外,,再設(shè)置一個(gè)FL2 Vs SSC點(diǎn)圖,,有利于排除一些帶有色素的細(xì)胞器的干擾。 |
1.研究背景 1.1原生質(zhì)體的概念 植物原生質(zhì)體是指去除細(xì)胞壁被質(zhì)膜所包圍的,、具有活力的細(xì)胞,,其結(jié)構(gòu)包括細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)(包括各種細(xì)胞器,、細(xì)胞骨架系統(tǒng)及胞基質(zhì))和細(xì)胞核等部分,。原生質(zhì)體培養(yǎng)和植株再生技術(shù)具有使用范圍廣、可行性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),,是植物生物工程的基礎(chǔ),。對(duì)植物原生質(zhì)體的研究,可追溯到20世紀(jì)60年代,英國(guó)植物學(xué)家Cocking用酶解方法降解細(xì)胞壁,,獲得了番茄根尖原生質(zhì)體,,自此原生質(zhì)體的研究得到迅速發(fā)展。近年來,,由于原生質(zhì)體具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,、發(fā)育同步性好、群體數(shù)量大,、DNA分子易于進(jìn)入細(xì)胞,,易獲得純合性轉(zhuǎn)化子的特點(diǎn),及其培養(yǎng)技術(shù)與有關(guān)的細(xì)胞,、分子和遺傳等學(xué)科的交叉滲透,,使植物原生質(zhì)體的研究越來越受到重視。研究領(lǐng)域也從分離原生質(zhì)體進(jìn)行的生理生化和利用不同材料的原生質(zhì)體得到再生植株的階段轉(zhuǎn)到原生質(zhì)體的應(yīng)用(尤其是遺傳性狀改良)方面,。 1.2原生質(zhì)體的制備 原生質(zhì)體的分離方法有兩種:機(jī)械分離法和酶解分離法,。機(jī)械分離法由于產(chǎn)量低、方法繁瑣費(fèi)力,;以及對(duì)分生組織和液泡化程度不高的細(xì)胞不適用的特點(diǎn),,現(xiàn)在已很少有人使用。 酶解分離法為目前普遍采用的原生質(zhì)體分離方法,。酶解是在25~28 ℃的恒溫,、黑暗或弱光下進(jìn)行;酶解后經(jīng)過0.038 mm孔徑左右的鎳絲網(wǎng)過濾,,濾去消解不*的組織碎塊(導(dǎo)管,、篩管等)和細(xì)胞團(tuán)。然后將濾液離心,,棄去上清液,,將離心下來的原生質(zhì)體重新懸浮在洗液(CPW)中,再次離心,,去上清液,,重復(fù)3 次。在倒置顯微鏡下檢查純化效果,,效果好,,用原生質(zhì)體培養(yǎng)基離心,效果不好,,用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的蔗糖離心,,使完整的原生質(zhì)體浮于液面。 1.3原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化 1)生物介質(zhì)介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化,。目前應(yīng)用的生物介質(zhì)主要是根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌,。它們轉(zhuǎn)化的原理分別是通過活化Ti 和Ri 質(zhì)粒的Vir 區(qū)基因,,達(dá)到對(duì)T-DNA 轉(zhuǎn)移的目的。2)細(xì)胞融合法,。PEG介導(dǎo)法由Davey 等首先建立,,主要原理是借助細(xì)胞融合劑誘導(dǎo)原生質(zhì)體攝取外源DNA,。PEG法的融合率可達(dá)10%~15%,,無種屬特異性,幾乎可誘導(dǎo)任何原生質(zhì)體的融合,。細(xì)胞電融合法利用細(xì)胞在相對(duì)電極之間的介電電泳,,誘導(dǎo)細(xì)胞按特定方向排列,通過電極間產(chǎn)生的較高場(chǎng)強(qiáng)的電脈沖使相互接觸的細(xì)胞發(fā)生電穿孔,,進(jìn)而發(fā)生電融合,。3)激光微束穿刺法。激光微束穿刺法就是利用直徑很小,、能量很高的激光微束引起細(xì)胞膜可逆性穿孔,,從而使處于細(xì)胞周圍的外源DNA 隨之進(jìn)入細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因方法。激光微束穿刺法操作簡(jiǎn)便,,對(duì)細(xì)胞的損傷小,,可以準(zhǔn)確定位于被照射的細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好,。4)電擊法是利用高壓電脈沖作用,,在原生質(zhì)體膜上“電擊穿孔”,形成可逆的瞬間通道,,從而促進(jìn)外源DNA的攝入,。 1.4原生質(zhì)體的應(yīng)用 由于原生質(zhì)體失去了細(xì)胞壁這一屏障,因而使其具有特殊的優(yōu)點(diǎn),。原生質(zhì)體不僅可作為一個(gè)單細(xì)胞系統(tǒng)來研究細(xì)胞壁再生,、細(xì)胞分裂與分化、攝入細(xì)胞器,、病毒侵染機(jī)理,、膜透性及離子轉(zhuǎn)運(yùn)等基礎(chǔ)理論研究的理想材料;同時(shí)還是原生質(zhì)體培養(yǎng)和原生質(zhì)體融合的基礎(chǔ),。而且,,近年來以原生質(zhì)體為材料利用膜片鉗技術(shù)研究離子通道及原生質(zhì)體在受光、脅迫和激素作用后的調(diào)節(jié)機(jī)制已成為研究的熱點(diǎn),。此外,,原生質(zhì)體也被用來作為研究植物細(xì)胞鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及其調(diào)節(jié)機(jī)制的理想材料。 |
3.實(shí)驗(yàn)方法 3.1 分離原生質(zhì)體 前一天晚上 1. 使用約15 mL protoplast enzyme solution消化細(xì)胞壁,。 A. 選用生長(zhǎng)1-3 周的植株 (請(qǐng)根據(jù)需要自行優(yōu)化條件) 。 B. 23oC,,孵育7-12小時(shí),,溫和震蕩混勻。 *天,,上午 2. 用100 ?m濾網(wǎng)過濾收集細(xì)胞至標(biāo)記好的培養(yǎng)皿中,。 3. 在50 ml 管中加入等體積的21% 蔗糖溶液。 4. 將第二步的細(xì)胞溶液加入第三步的蔗糖溶液中,。 5. 梯度離心10 min,,750 rmp。 6. 用藍(lán)槍頭從上層中吸取健康的完整的細(xì)胞,。 7. 用等體積的W5溶液重懸細(xì)胞,。 8. 離心,500 rmp,,5min,。 9. 用W5溶液重懸細(xì)胞沉淀。 10. 將細(xì)胞置于4 oC 保存直至使用,。 |
3.2 PEG-介導(dǎo)轉(zhuǎn)化 *天,,下午 1. 準(zhǔn)備用于PEG轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體 A. 預(yù)冷新鮮制備的PEG溶液。 B. 500 rpm,,1 min,,離心原生質(zhì)體。 C. 用MaMg 溶液重懸細(xì)胞至合適濃度: 106數(shù)量級(jí), 至少300 ?l體積,。 D. 加DNA至一個(gè)新的14ml圓底管中– 所加DNA的量取決于表達(dá)水平,。 E. 加300 ?l 細(xì)胞溶液至管中,溫和混勻,。 2. PEG轉(zhuǎn)化 A. 用等體積的PEG(300 ?l + DNA volume)和原生質(zhì)體 & DNA溶液(step E)混勻,,注意要非常溫和。 B. 室溫孵育30 min,。 3. 用W5溶液逐漸稀釋去除PEG A. 700 ?l, 5 min -用剪掉末端的槍頭上下溫和吹打,。 B. 1 ml, 3 min; 2 ml – 每一步溫和的轉(zhuǎn)動(dòng)管子。 C. 離心,,500 rpm,,5min,棄上清,。 4. 用1 ml W5 溶液重懸細(xì)胞沉淀,。 5. (可選) 從未轉(zhuǎn)化的對(duì)照組中分離蛋白進(jìn)行Western檢測(cè)。 6. 將細(xì)胞置23oC孵育 1-3 天,。 |
3.3 流式分選Protoplast 1. 對(duì)原生質(zhì)體進(jìn)行計(jì)數(shù),,調(diào)整原生質(zhì)體濃度為5*10^6/mL,。 2. 使用BD FACSAriaIII流式細(xì)胞儀進(jìn)行分選,收集GFP+原生質(zhì)體,。 A.打開準(zhǔn)備好的流式細(xì)胞分選儀,,本實(shí)驗(yàn)使用的是BD FACSAriaIII。 B.儀器設(shè)置為:100µm噴嘴,,20 psi鞘液壓力,。 C.細(xì)胞密度和樣本上樣速度可以根據(jù)特定需要加以調(diào)整——要高得率還是高速度。 D.使用樣本混勻功能,,防止在分選過程中原生質(zhì)體發(fā)生沉降,。 E.畫一張F(tuán)SC/SSC散點(diǎn)圖,,調(diào)節(jié)電壓使細(xì)胞群體出現(xiàn)在散點(diǎn)圖的*,。 F.再畫一張GFP/PE-Texas Red散點(diǎn)圖,調(diào)節(jié)電壓,,使野生型對(duì)照原生質(zhì)體群體(non-GFP) 出現(xiàn)在散點(diǎn)圖的*,,GFP陽(yáng)性原生質(zhì)體群體會(huì)在GFP熒光通道信號(hào)更強(qiáng)的位置現(xiàn)(在野生型對(duì)照樣本中沒有這個(gè)群體)。 G.如有必要,,調(diào)節(jié)補(bǔ)償,,使GFP陰性和陽(yáng)性原生質(zhì)體群體分得更開。 H.設(shè)置門,,圈住GFP陽(yáng)性群體,。需要準(zhǔn)備一個(gè)non-GFP原生質(zhì)體陰性對(duì)照(Figure 1.)用以確定門的界限。 I.根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要以及目的細(xì)胞的百分比,,選擇合適的分選模式——高得率或者高純度,。 注:初始條件可選取100µm噴嘴,20 psi鞘液壓力,。后期根據(jù)樣本狀態(tài)的不同,,可以進(jìn)一步優(yōu)化分選條件,包括:選擇更大的噴嘴尺寸,,更低的鞘液壓力,,用戶自定義分選模式,優(yōu)化原生質(zhì)體培養(yǎng)緩沖液,,使用原生質(zhì)體培養(yǎng)緩沖液替代鞘液,,直接分選原生質(zhì)體到培養(yǎng)皿中等,都有助于保護(hù)分選后原生質(zhì)體的活性,。 3. 對(duì)分選后得到的GFP+原生質(zhì)體進(jìn)行離心,,棄上清。 4. 分選原生質(zhì)體后續(xù)實(shí)驗(yàn),,分析原生質(zhì)體基因組DNA,,蛋白或代謝產(chǎn)物表達(dá)水平,。 |