試劑盒使用說明書
檢測范圍：3.12 pg/ml - 200 pg/ml
zui低檢測限：0.78 pg/ml
有效期：6個月
預期應用：ELISA法定量測定大鼠血清、血漿,、細胞培養(yǎng)上清或其它相關生物液體中IL-1β含量,。
說明
1．試劑盒保存：-20℃（較長時間不用時）；2-8℃（頻繁使用時）,。
2．濃洗滌液低溫保存會有鹽析出,，稀釋時可在水浴中加溫助溶。
3．中,、英文說明書可能會有不一致之處,，請以英文說明書為準。
4．剛開啟的酶聯板孔中可能會含有少許水樣物質,，此為正?，F象，不會對實驗結果造成任何影響,。
概述
白介素-1（IL-1）又稱淋巴細胞刺激因子，分為IL-1α和IL-1β兩種,，它們由不同的基因所表達,，分子量為15kDa，但其PI分別為5和7,。兩者分別由159和153個氨基酸組成,，氨基酸順序之間只有26%的同源性，但與同一種膜受體相結合,。IL-1主要由血液中的單核細胞和巨噬細胞所產生,。T淋巴細胞，B淋巴細胞,，各種上皮細胞,，內皮細胞和間質細胞也能產生IL-1。血液中的IL-1主要為單核細胞和巨噬細胞所產生的IL-1β,。IL-1是急性期免疫反應的主要調節(jié)因子,，它在T細胞激活，誘導IL-2產生起著基本的作用,。這些調節(jié)作用的產生主要通過作用在神經系統(tǒng),，骨髓干細胞發(fā)生作用。這些調節(jié)作用大多數是IL-1β直接產生的,，但有些是于其他細胞因子如IL-6,、IFN、TNF協同作用下發(fā)揮效應的,。正常人血液中不含IL-1β或者含量很底,。IL-1含量升高表明機體內有組織損傷或者感染產生，如階段性回腸炎敗血癥等。神經系統(tǒng)的炎癥和損傷時,，腦脊液中IL-1水平上升,。在感染性胸膜，腹膜滲出液中,，IL-1水平上升,。
實驗原理
用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體,，往包被抗IL-1β抗體的微孔中依次加入標本或標準品,、生物素化的抗IL-1β抗體、HRP標記的親和素,，經過*洗滌后用底物TMB顯色,。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的IL-1β呈正相關,。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度,。
試劑盒組成及試劑配制
1. 酶聯板（Assay plate ）：一塊（96孔）,。
2. 標準品（Standard）：2瓶（凍干品）。
3. 樣品稀釋液（Sample Diluent）：1×20ml/瓶,。
4. 生物素標記抗體稀釋液（Biotin-antibody Diluent）：1×10ml/瓶,。
5. 辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液 （HRP-avidin Diluent）：1×10ml/瓶。
6. 生物素標記抗體（Biotin-antibody）：1×120μl/瓶（1：100）
7. 辣根過氧化物酶標記親和素（HRP-avidin）：1×120μl/瓶（1：100）
8. 底物溶液（TMB Substrate）：1×10ml/瓶,。
9. 濃洗滌液（Wash Buffer）：1×20ml/瓶,，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。
10. 終止液（Stop Solution）：1×10ml/瓶（2N H2SO4）,。
需要而未提供的試劑和器材
1. 標準規(guī)格酶標儀
2. 高速離心機
3. 電熱恒溫培養(yǎng)箱
4. 干凈的試管和Eppendof管
5. 系列可調節(jié)移液器及吸頭,，一次檢測樣品較多時，用多通道移液器
6. 蒸餾水,，容量瓶等
標本的采集及保存
1. 血清：全血標本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000 x g離心20分鐘,，取上清即可檢測，或將標本放于-20℃或-80℃保存,，但應避免反復凍融,。
2. 血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本采集后30分鐘內于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘,，或將標本放于-20℃或-80℃保存,，但應避免反復凍融。
3. 細胞培養(yǎng)物上清或其它生物標本：1000 x g離心20分鐘,，取上清即可檢測,，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
注：標本溶血會影響zui后檢測結果,，因此溶血標本不宜進行此項檢測,。
標本的稀釋原則：
首先通過文獻檢索的方式了解待測樣本的大致含量，確定適當的稀釋倍數,。只有稀釋至標準曲線的范圍內,，檢測的結果才是準確的。稀釋的過程中,，應做好詳細的記錄,。zui后計算濃度時，稀釋了“N”倍,，標本的濃度應再乘以“N”,。
標準品的稀釋原則：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml,，蓋好后靜置10分鐘以上,，然后反復顛倒/搓動以助溶解，其濃度為200 pg/ml,，做系列倍比稀釋后,，分別稀釋200 pg/ml，100 pg/ml,，50 pg/ml，25 pg/ml,，12.5 pg/ml,，6.25 pg/ml，3.12 pg/ml,，樣品稀釋液直接作為標準濃度0 pg/ml,，臨用前15分鐘內配制。
如配制100 pg/ml標準品：取0.5ml（不要少于0.5ml）200 pg/ml的上述標準品加入含0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,，混勻即可,，其余濃度以此類推。
生物素標記抗體的稀釋原則：
臨用前以生物素標記抗體稀釋液稀釋,，稀釋前根據預先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100μl）,，實際配制時應多配制0.1-0.2ml。如10μl生物素標記抗體加990μl生物素標記抗體稀釋液的比例配制,，輕輕混勻,，在使用前一小時內配制。
臨用前以辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液稀釋,，稀釋前根據預先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100μl）,，實際配制時應多配制0.1-0.2ml。如10μl辣根過氧化物酶標記親和素加990μl辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液 的比例配制，輕輕混勻,，在使用前一小時內配制,。
操作步驟
實驗開始前，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭?，試劑或樣品稀釋時,，均需混勻，混勻時盡量避免起泡,。每次檢測都應該做標準曲線,。如樣品濃度過高時，用樣品稀釋液進行稀釋,，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍,。
1. 加樣：分別設空白孔、標準孔,、待測樣品孔,。空白孔加樣品稀釋液100μl,，余孔分別加標準品或待測樣品100μl,，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標板孔底部,，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜,，37℃反應120分鐘,。
為保證實驗結果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液,。
2. 棄去液體,，甩干，不用洗滌,。每孔加生物素標記抗體工作液 100μl（取1μl生物素標記抗體加99μl生物素標記抗體稀釋液的比例配制,，輕輕混勻，在使用前一小時內配制）,，37℃,60分鐘,。
3. 溫育60分鐘后，棄去孔內液體,，甩干,，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘,，350μl/每孔,，甩干,。
4. 每孔加辣根過氧化物酶標記親和素工作液（同生物素標記抗體工作液） 100μl，37℃,，60分鐘,。
5. 溫育60分鐘后，棄去孔內液體,，甩干,，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘,，350μl/每孔,，甩干。
6. 依序每孔加底物溶液90μl,，37℃避光顯色（30分鐘內,，此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度藍色，后3-4孔梯度不明顯,，即可終止）,。
7. 依序每孔加終止溶液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）,。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同,。為了保證實驗結果的準確性，底物反應時間到后應盡快加入終止液,。
8. 用酶聯儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）,。 在加終止液后15分鐘以內進行檢測。
注：
1. 用戶在初次使用試劑盒時,，應將各種試劑管離心數分鐘,，以便試劑集中到管底。
2. 每次實驗留一孔作為空白調零孔,，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2N H2SO4,。測量時先用此孔調OD值至零,。
3. 為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內,，酶標板加上蓋或覆膜,。
4. 未使用完的酶標板或者試劑，請于2-8℃保存,。標準品,、生物素標記抗體工作液、辣根過氧化物酶標記親和素工作液請依據所需的量配置使用,。請勿重復使用已稀釋過的標準品,、生物素標記抗體工作液或,、辣根過氧化物酶標記親和素工作液。
5. 建議檢測樣品時均設雙孔測定,，以保證檢測結果的準確性,。
洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙,，酶標板朝下用力拍幾次,；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內，浸泡1-2分鐘,。根據需要,，重復此過程數次。
自動洗板：如果有自動洗板機,，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中,。
計算
以標準物的濃度為橫坐標（對數坐標），OD值為縱坐標（普通坐標）,，在半對數坐標紙上繪出標準曲線,，根據樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數,；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式,，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度,，再乘以稀釋倍數,，即為樣品的實際濃度。
注意事項
1. 當混合蛋白溶液時應盡量輕緩,，避免起泡,。
2. 洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性,。
3. 一次加樣時間控制在5分鐘內,，如標本數量多，推薦使用排槍加樣,。
4. 請每次測定的同時做標準曲線,，做復孔。
5. 如標本中待測物質含量過高,，請先稀釋后再測定,，計算時請zui后乘以稀釋倍數。
6. 在配制標準品,、檢測溶液工作液時,，請以相應的稀釋液配制，不能混淆,。
7. 底物請避光保存,。
