常用實(shí)驗(yàn)方法學(xué)

一、肝素的配制

市售肝素凍干粉是140單位/mg,，1克瓶裝，每瓶140,000單位,。稱取0.1克肝素凍干粉,，加生理鹽水5ml，配成2800單位/ml,。取50~100μl濕潤管壁,，可抗凝人血3~5ml,。血液不會(huì)凝固。老鼠血易凝固,，所以濃一些,。可以取0.1克肝素凍干粉,，加3ml生理鹽水溶解后,，取50~100μl，可抗凝鼠血2~4ml,。

肝素抗凝管的制備：取0.1克肝素凍干粉,，加2.5ml生理鹽水。取100μl~150μl滴入塑料或玻璃管中,，濕潤管壁,，低于80℃小烤箱中（可以用烤面包的小烤箱），橫向轉(zhuǎn)動(dòng),，每隔5~10分鐘轉(zhuǎn)動(dòng)一次,，直至干燥后放入4℃保存，可使2~5ml血液不凝固,。

二,、組織勻漿的制備

1、取組織塊（0.2g~1g）zui少可到2~5mg在冰冷的生理鹽水中漂洗,，除去血液,，濾紙拭干，稱重,，放入5或10ml的小燒杯內(nèi),。

2、用移液管量取預(yù)冷的勻漿介質(zhì)（ph7.4,，0.01mol/L Tris-HCI,，0.0001mol/L EDTA-2Na,0.01mol/L蔗糖 0.8的氯化鈉溶液）或者用0.86冷生理鹽水，勻漿介質(zhì)或者生理鹽水的體積總量應(yīng)該是組織塊重量的9倍,，用移液管或移液器取總量2/3的勻漿介質(zhì)或者生理鹽水于燒杯中,，用眼科小剪盡快剪碎組織塊（天熱時(shí)操作要在冰水浴中進(jìn)行，將盛有組織的小燒杯放入冰水中）,。

3,、勻漿的方式有多種：手工勻漿，機(jī)器勻漿,，超聲粉碎,，反復(fù)凍融。

①手工勻漿：將剪碎的組織倒入玻璃勻漿管中，再將剩余的1/3勻漿介質(zhì)或冷生理鹽水沖洗殘留在燒杯中的碎組織塊,，一起倒入勻漿管中進(jìn)行勻漿,，左手持勻漿管將下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手將搗桿垂直插入套管中,，上下轉(zhuǎn)動(dòng)研磨數(shù)十次（6~8分鐘）,，充分研碎，使組織勻漿化,。

②機(jī)器勻漿：用組織搗碎機(jī)10000~15000r/min上下研磨制成10組織勻漿,，也可用內(nèi)切式組織勻漿機(jī)制備（勻漿時(shí)間10秒/次，間隙30秒,，連續(xù)3~5次,，在冰水中進(jìn)行），皮膚,、肌肉組織等可延長勻漿時(shí)間,。

③超聲粉碎：用超聲粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，可用Soniprep型超聲波發(fā)生器以振幅14微米超聲處理30秒使細(xì)胞破碎,，也可用國產(chǎn)超聲波發(fā)生儀,，用400安培，5秒/次,，間隙10秒反復(fù)3~5次,。

④反復(fù)凍融：培養(yǎng)或者分離的細(xì)胞可以用以上①②③的方法勻漿，也可以反復(fù)凍溶3次左右（即讓細(xì)胞加適量的低滲液或者雙蒸水放低溫冰箱中結(jié)冰,，溶解,，再結(jié)冰，再溶解,。反復(fù)3次左右）,，但有部分酶活力會(huì)受影響。

⑤取少量組織勻漿作涂片（直接涂片,、染色均可以）,，顯微鏡下觀察細(xì)胞是否磨破，若沒有破則可延長勻漿時(shí)間或增加凍溶次數(shù)（此步可省略）,。

4,、將制備好的10勻漿用普通離心機(jī)或低溫低速離心機(jī)2000r/min左右離心10~15分鐘，若檢測ATP酶,，則只需要1000轉(zhuǎn)/分,，離心5分鐘，將離心好的勻漿留上清棄下面的沉淀,。

根據(jù)你的實(shí)驗(yàn)需要,，取適量上清液進(jìn)行各種測定。

三,、線粒體及微粒體的提取

（一）制備10的組織勻漿（制備方法見上述組織勻漿的制備1,、2、3）

（二）制備線粒體：取10組織勻漿,，用普通離心機(jī)或低溫低速離心機(jī)以1000~2000r/min離心10分鐘,，棄沉淀，取上清液以8000~10000r/min（低溫高速離心機(jī)）離心15分鐘,，沉淀物位線粒體,。

（三）胞漿部分：分離線粒體后的上清液即為胞漿。

（四）制備微粒體：取分離線粒體后的上清液即胞漿,，以144000g即40000r/min離心30分鐘,，沉淀物為微粒體。

（五）將分離的線粒體或微粒體分別用冰冷的勻漿介質(zhì)制備成混淆液,，用手工勻漿或機(jī)器勻漿使線粒體會(huì)微粒體破碎,，或者用somiprep150型超聲發(fā)生器以振幅14微米超聲處理30秒，或者用國產(chǎn)超聲波發(fā)生儀,，400安培,，5秒/次，間隙10秒反復(fù)3~5次,。使線粒體或微粒體破碎,，待測酶活力，也可用反復(fù)凍融的方法使其破碎,，但有部分酶活力會(huì)受影響,。

（六）制備好的線粒體、微粒體,、胞漿部分可根據(jù)您的需要分別進(jìn)行各種測定,。

四、線粒體的鑒定（中性紅—詹納斯綠B染色）

在兩張干凈載玻片*各滴2~3滴中性紅—詹納斯綠B染液,，待其中的酒精蒸發(fā)*后,，用牙簽挑少許沉淀物均勻涂布在一張玻片的染液中；另取上清液一滴,，混于另一張玻片的染液中,，兩片分別蓋上蓋玻片，染色5分鐘,，在高倍鏡下觀察,，被染成亮綠色顆粒即線粒體。

中性紅—詹納斯綠B染色的配制：

A液：取詹納斯綠B（Jana’s green B）飽和水溶液（溶解度5.18）3滴滴入5ml無水乙醇中,，混勻,。

B液：取飽和中性紅（Neu—tral red）水溶液（10mg中性紅溶于150ml蒸餾水中，并用黑紙包好貯冰箱）20~30滴滴入5ml無水乙醇中，混勻,。

用時(shí)將A液和B液呼喝即成中性紅—詹納斯綠B染液（混合液中的燃料部穩(wěn)定會(huì)在24小時(shí)內(nèi)發(fā)生沉淀）,。

注：1,、若發(fā)現(xiàn)涂片上有成團(tuán)的染料可將詹納斯綠B3滴改成1滴或2滴，而將中性紅20~30滴改成10~20滴。

2,、本研究所線粒體制備方法較為成熟,，一般不需要染色鑒定,。

五,、勻漿介質(zhì)的制備

配制1000mlpH7.4，0.01mol/L Tris-HCI,0.0001mol/L EDTA-2Na,0.01mol/L 蔗糖,，0.8氯化鈉溶液,。

三劉甲基氨基甲烷 Tris   分子量121.14， 乙二胺四乙酸二鈉EDTA  分子量372.24,，

蔗糖  分子量342.3

稱取  Tris             121.4*0.01=1.21g

          EDTA-2Na       372.24*0.0001=37.23mg

          蔗糖            342.3*0.01=3.42g

          氯化鈉          8克

將Tris 1.21g及EDTA·2Na 37.23mg加水500ml,，再用200mmol/L HCI進(jìn)行滴定至pH7.4，然后加入3.42克蔗糖,，8克氯化鈉,，再用蒸餾水補(bǔ)充至1000ml，放入鹽水瓶中,，以9磅壓力進(jìn)行消毒或者微波爐消毒3~5分鐘后放4℃冰箱中備用（也可用生理鹽水代替勻漿介質(zhì)）,。

六、紅細(xì)胞中SOD的抽提

1,、采集手指血,、或肝素抗凝的靜脈血或動(dòng)脈血50µ1[注1]，沖入盛有2～4ml的生理鹽水的帶刻度離心管中,，2000轉(zhuǎn)/分 離心3分鐘,。

2、用玻璃吸管吸去上清液（要吸干凈）,，留沉淀的紅細(xì)胞,。

3、加入預(yù)冷的雙蒸水0.2ml,，混勻（使紅細(xì)胞溶解）

4,、加入95乙醇0.1ml，振蕩30秒,。

5,、加入三氯甲烷（氯仿）0.1ml置漩渦混勻器充分混勻（抽提）一分鐘。

6,、3500轉(zhuǎn)/分 離心8分鐘,。

   此時(shí)液體分三層：上層為SOD抽提液,，中層為血紅蛋白沉淀物，下層為三氯甲烷,。若上清有渾濁可加入少量固體NaCl后再離心5分鐘,，即可澄清。

記錄上清液體積,，取5～20µ1作SOD測定[注2]

[注1]：大,、小鼠可取內(nèi)眥血,，用玻璃毛細(xì)管從眥部斜向咽喉方向刺入,，或者剪尾取血，將血滴在含肝素并烤干的玻片上（烤干時(shí)溫度要低于80℃）,，再用移液器取50µ1血,，作SOD抽提。血量少時(shí)可取10～20µ1抗凝全血（做慢性動(dòng)物試驗(yàn),，在飼養(yǎng)過程中可以反復(fù)取血5～6次,。

[注2]：紅細(xì)胞中只有銅鋅SOD，沒有錳SOD,。

七,、紅細(xì)胞膜的制備

  1、原理和應(yīng)用  哺乳動(dòng)物細(xì)胞是生物質(zhì)膜zui方便,，的來源,，除來源廣泛以外，這種細(xì)胞還不含任何細(xì)胞器,，從而可以得到一種純凈的細(xì)胞質(zhì)膜,。紅細(xì)胞血影（ghost）膜主要是采用低滲透處理來獲得的，在低滲介質(zhì)中,，紅細(xì)胞膨脹,，由雙面盤狀變成近乎球形，隨后細(xì)胞內(nèi)容物包括血紅蛋白成分因細(xì)胞破裂而釋放出來,。zui后,，通過離心沉淀技術(shù)可獲得純凈的紅細(xì)胞膜（又稱紅細(xì)胞血影膜）。

2,、儀器和設(shè)備：常速離心機(jī)和低溫高速離心機(jī),。

3、試劑（建成生物工程研究所可訂購）

（1）等滲緩沖液（本所有售）

（2）低滲緩沖液（本所有售）