目前引物合成基本采用固相亞磷酰胺三酯法。DNA合成儀有很多種,， 主要是由ABI/PE 公司生產(chǎn),。合成的原理基本相同，主要差別在于合成產(chǎn)率的高低,、試劑消耗量和單個循環(huán)用時的不同,。

        亞磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有,、快速偶聯(lián)以及起始反應(yīng)物比較穩(wěn)定的特點,。該方法是在固相載體上完成DNA鏈的合成的，合成的方向是沿待合成引物的3‘端向5‘端合成,，相鄰的核苷酸通過3‘→5‘磷酸二酯鍵連接,。

    *步，三氯乙酸和預(yù)先連接在固相載體（CPG）上的核苷酸反應(yīng)（其活性基團處于被保護狀態(tài)）,，脫去核苷酸5‘-羥基的保護基團DMT,，獲得游離的5‘-羥基；

    第二步,，合成DNA的原料（亞磷酰胺保護的核苷酸單體）與活化劑四氮唑混合,，得到核苷亞磷酸活化中間體，它的3‘端被活化,，5‘-羥基仍然被DMT保護,，與溶液中游離的5‘-羥基發(fā)生縮合反應(yīng)；

    第三步,，帶帽（capping）反應(yīng),，縮合反應(yīng)中可能有極少數(shù)5‘-羥基沒有參加反應(yīng)（少于2%）,，用乙酸酐和1-甲基咪唑終止其后繼續(xù)發(fā)生反應(yīng)，這種短片段可以在純化時分離掉,；

    第四步,，在氧化劑碘的作用下，亞磷酰形式轉(zhuǎn)變?yōu)楦€(wěn)定的磷酸三酯,。

    經(jīng)過以上四個步驟，一個脫氧核苷酸被連接到固相載體的核苷酸上,。再以三氯乙酸脫去它的5‘-羥基上的保護基團DMT,，重復(fù)以上步驟，直到所有要求合成的堿基被接上去,。合成過程中可以觀察TCA處理階段的顏色判定合成效率,。

    通過氨水高溫處理，連接在CPG上的引物被切下來,，通過OPC, PAGE等手段純化引物,，成品引物用C18濃縮、脫鹽,，測定OD260定量,，根據(jù)定單要求分裝。