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深度解讀熒光定量PCR儀所運用的技術(shù)

時間:2018-6-28 閱讀:6630
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   深度解讀熒光定量PCR儀所運用的技術(shù)
  熒光定量PCR儀所用到的實時熒光定量PCR技術(shù)是通過對PCR擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實時檢測,而實現(xiàn)對起始模板定量及定性分析的目的,。在實時熒光定量PCR反應(yīng)中,,引入了一種熒光化學(xué)物質(zhì),,隨著PCR反應(yīng)的進行,PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計,,熒光信號強度也等比例增加,。每經(jīng)過一個循環(huán),收集一個熒光強度信號,,這樣就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化,,從而得到一條熒光擴增曲線圖,達到監(jiān)測PCR產(chǎn)物擴增量的目的,。
  一般而言,,熒光擴增曲線可以分成三個階段:熒光背景信號階段、熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期,。在熒光背景信號階段,,擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋,無法判斷產(chǎn)物量的變化,;而在平臺期,,擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級增加,PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系,,因此根據(jù)終的PCR產(chǎn)物量不能計算出起始DNA拷貝數(shù),。只有在熒光信號指數(shù)擴增階段,PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系,,故選擇該階段進行定量分析,。為了較方便的進行DNA拷貝數(shù)的定量,在實時熒光定量PCR技術(shù)中引入了三個非常重要的概念:基線,、熒光閾值和Ct值,。
  基線:是指在PCR擴增反應(yīng)的初數(shù)個循環(huán)里,熒光信號變化不大,,接近于一條直線,,該直線即是基線,。
  熒光域值:一般將PCR反應(yīng)前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號,熒光域值是PCR反應(yīng)3-15個循環(huán)熒光信號標(biāo)準(zhǔn)差的10倍,,熒光域值設(shè)定在PCR擴增的指數(shù)期,。
  Ct值:表示每個PCR反應(yīng)管內(nèi)熒光信號到達設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。各模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系,,起始拷貝數(shù)越多,,Ct值越小,反之亦然,。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)難曲線,,其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù),縱坐標(biāo)代表Ct值,。因此只要獲得未知樣品的Ct值,,即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。
  熒光定量PCR儀的實時熒光定量PCR技術(shù)是DNA定量技術(shù)的一次飛躍,。運用該項技術(shù)我們可以對DNA,、RNA樣品進行定量和定性分析。定量分析包括jue對定量分析和相對定量分析,。前者可以得到某個樣本中基因的拷貝數(shù)和濃度,;后者可以對不同方式處理的兩個樣本中的基因表達水平進行比較。除此之外還可以對PCR產(chǎn)物或樣品進行定性分析,,利用特異性探針進行基因型分析及SNP檢測等。目前實時熒光PCR技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)科學(xué)研究,、臨床診斷,、疾病研究及藥物研發(fā)等領(lǐng)域,其中主要的應(yīng)用集中在以下幾個方面:
  1.DNA或RNA的jue對定量分析,。包括病原微生物或病毒含量的檢測,,轉(zhuǎn)基因動植物轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的檢測,RNAi基因失活率的檢測等,。
  2.基因表達差異分析,。如比較經(jīng)過不同處理樣本之間特定基因的表達差異(如藥物處理、物理處理,、化學(xué)處理等),,特定基因在不同時相的表達差異以及cDNA芯片或差顯結(jié)果的確證。
  3.基因分型,。例如SNP檢測,,甲基化檢測等。

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