FailSafe™ PCR系統(tǒng)

一個(gè)可信賴的持續(xù)擴(kuò)增常規(guī)及非常規(guī)模板的新系統(tǒng)

Haiying Grunenwald, EPICENTRE Technologies
 

介紹：
    成功的PCR依賴于包括模板質(zhì)量,，所選酶,，設(shè)計(jì)的引物以及所采用的擴(kuò)增條件在內(nèi)的多重因素,。一個(gè)理想的PCR系統(tǒng)應(yīng)當(dāng)能夠：

（1）擴(kuò)增包括難擴(kuò)增（如高GC含量或二級(jí)結(jié)構(gòu)）及長(zhǎng)序列在內(nèi)的各種類型模板

（2）高保真擴(kuò)增

（3）簡(jiǎn)便易行，進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)無需優(yōu)化條件

    然而目前還沒有一個(gè)PCR系統(tǒng)能同時(shí)滿足這些要求,。在此,，我們介紹FailSafe PCR系統(tǒng)，它可以確保成功及持續(xù)地?cái)U(kuò)增常規(guī)及非常規(guī)模板,，包括長(zhǎng)序模板（長(zhǎng)至20kb）和高GC含量模板（GC含量>80%）,。 由于普通Taq酶的擴(kuò)增能力很強(qiáng),，但是錯(cuò)配率高,，在出現(xiàn)錯(cuò)配時(shí)酶會(huì)脫離模版而導(dǎo)致Taq酶通常只能擴(kuò)較小的片段（<3kb）；常規(guī)的高保真酶如Pfu,、Vent帶校正功能而擴(kuò)增能力較弱,，本系統(tǒng)綜合二者的優(yōu)點(diǎn)：FailSafe PCR酶混合物是含有一個(gè)3’--5’高保真校讀酶的Taq酶混合物，可以高保真地?cái)U(kuò)增長(zhǎng)片段的PCR產(chǎn)物,，產(chǎn)物可以直接克隆入TA或平端載體,；另一個(gè)成分是一套FailSafe PCR PreMixes，它由緩沖液,，dNTPs,，各種含量的MgCl₂以及FailSafe PCR增強(qiáng)劑（含甜菜堿）組成。使用者只需簡(jiǎn)單地將模板,，引物,，F(xiàn)ailSafe PCR酶混合物加入FailSafe PCR PreMixes即可進(jìn)行擴(kuò)增,。無需繁瑣地進(jìn)行條件優(yōu)化，PreMixes中的FailSafe PCR增強(qiáng)劑可以增加PCR反應(yīng)的特異性,，敏感性及持續(xù)性,。

    本文中，我們比較了FailSafe PCR系統(tǒng)與其它商品化的PCR酶及酶混合物的擴(kuò)增保真度,，還證明了利用FailSafe PCR系統(tǒng)可以擴(kuò)增長(zhǎng)序,，難擴(kuò)增序列模板以及進(jìn)行多重PCR。

材料與方法：
1. FailSafe PCR酶混合物的保真度
    克隆,，表達(dá),，突變分析和長(zhǎng)程PCR要求使用低錯(cuò)配率的酶。使用以PCR為基礎(chǔ)的正向突變分析,，我們比較了FailSafe PCR酶混合物與其它供應(yīng)商的酶及酶混合物的擴(kuò)增保真度,。該方法類似Cline等人的方法1，通過擴(kuò)增lacZ基因的a-互補(bǔ)區(qū),，使用藍(lán)/白克隆篩選分析評(píng)估序列的完整性,。擴(kuò)增反應(yīng)使用的試劑及方法依相應(yīng)廠商提供的進(jìn)行，之后逐次進(jìn)行高保真度分析,。結(jié)果表明FailSafe PCR酶混合物的保真度至少是標(biāo)準(zhǔn)Taq聚和酶的三倍,，與被測(cè)的其它高保真酶混合物相當(dāng)或更好。盡管有報(bào)道認(rèn)為FailSafe PCR酶混合物的保真度稍遜pfu DNA聚和酶,，但FailSafe PCR系統(tǒng)要強(qiáng)健得多,，可以從難擴(kuò)增模板（如高GC含量）和長(zhǎng)序模板獲得更特異和持續(xù)的擴(kuò)增，而在這方面pfu DNA聚和酶是欠缺的,。

2. 使用FailSafe PCR系統(tǒng)擴(kuò)增長(zhǎng)序列
    擴(kuò)增長(zhǎng)鏈模板經(jīng)常需要進(jìn)行繁瑣的反應(yīng)條件優(yōu)化（包括累加PCR）,，為了證明FailSafe PCR系統(tǒng)無需優(yōu)化各反應(yīng)因素即可擴(kuò)增長(zhǎng)鏈及標(biāo)準(zhǔn)模板，我們從l嗜菌體,，人及大腸桿菌基因組上擴(kuò)增長(zhǎng)度從5kb到21.5kb的片段,。

    對(duì)于每個(gè)模板/引物對(duì)結(jié)合物，使用FailSafe PCR PreMixes進(jìn)行PCR反應(yīng),。每50ml反應(yīng)體系中含1-500ng的基因組DNA（由模板決定）,，10-50pmol的各引物（由模板決定），2.5U的FailSafe PCR酶混合物以及25ml的FailSafe PCR 2´PreMix（A-L）,。嗜菌體模板擴(kuò)增反應(yīng)如下：94°C變性1min,，98°C，20sec,；56°C,，1min（擴(kuò)增5kb和10kb）/68°C，5min（擴(kuò)增5kb）/10min（擴(kuò)增10kb）或20min（擴(kuò)增20kb）,，共計(jì)20個(gè)循環(huán),。擴(kuò)增大腸桿菌基因組按以下程序進(jìn)行：94°C變性1min后,，擴(kuò)增6kb模板進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，其它進(jìn)行20個(gè)循環(huán)的98°C,，20sec,；68°C，5min（6kb）或10min（10kb）或20min（18kb）,。擴(kuò)增人基因組DNA程序：94°C,，1min，98°C,，20sec,；68°C，20min共14個(gè)循環(huán),，zui后是10個(gè)延伸時(shí)間增加15sec的循環(huán),。結(jié)果表明擴(kuò)增出的所有PCR產(chǎn)物產(chǎn)量高，特異性好,。

3. 使用FailSafe PCR系統(tǒng)擴(kuò)增GC富集模板
    如同PCR擴(kuò)增長(zhǎng)序列,，擴(kuò)增那些含大量GC或二級(jí)結(jié)構(gòu)的難擴(kuò)增模板經(jīng)常需要進(jìn)行條件優(yōu)化。為了證明使用FailSafe PCR系統(tǒng)可以不需優(yōu)化條件而進(jìn)行GC富集的模板的擴(kuò)增,，我們擴(kuò)增了人FMR1基因的250-350bp長(zhǎng)短的區(qū)域（GC含量為80-85%）2,。該基因CGG重復(fù)區(qū)的擴(kuò)大與脆性X染色體綜合癥相關(guān)。使用Epicentre的MasterPureä DNA純化試劑盒從血液中純化出人基因組DNA后,，利用FailSafe PCR PreMixes進(jìn)行PCR反應(yīng),。每50ml反應(yīng)體系中含100ng的基因組DNA，50pmol的各引物,，1.25U的FailSafe PCR酶混合物和25ml的FailSafe PCR 2´PreMix（A-L）,。94°C變性2min后，加入酶混合物,，擴(kuò)增反應(yīng)按以下程序進(jìn)行：94°C,，4min，30個(gè)98°C,，30sec,；65°C,，1min,；72°C，1min循環(huán),。用一套12個(gè)反應(yīng),，證明FailSafe PCR PreMix J擴(kuò)增FMR1脆性X基因的富含GC區(qū)*。

    對(duì)四個(gè)獨(dú)立樣本,，使用FailSafe PCR PreMix J和FailSafe PCR酶混合物進(jìn)行脆性X基因該區(qū)域的擴(kuò)增,。結(jié)果表明FailSafe PCR系統(tǒng)可以持續(xù)擴(kuò)增含80-85%GC的區(qū)域,。由于各樣品的CGG重復(fù)數(shù)不同，PCR產(chǎn)物的大小稍有不同,，長(zhǎng)度從250bp到350bp,。

4. 使用FailSafe PCR系統(tǒng)進(jìn)行多重?cái)U(kuò)增
    FailSafe PCR系統(tǒng)被檢測(cè)進(jìn)行多重?cái)U(kuò)增的能力。使用FailSafe PCR PreMixes擴(kuò)增囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白基因的五個(gè)外顯子3,。每50ml多重?cái)U(kuò)增PCR反應(yīng)體系中含500ng的基因組DNA,，25pmol的各引物2，2.5U的FailSafe PCR酶混合物和25ml的FailSafe PCR 2´PreMix,。94°C變性2min后,，加入酶混合物，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)：30個(gè)94°C,，10sec,；53°C，10sec,；74°C,，10sec循環(huán)，zui后74°C延伸5min,。

    CFTR基因的外顯子4,，10，11,，20和21的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別為423,，340，233,，289和396bp2,，結(jié)果表明使用FailSafe PCR PreMix C獲得*擴(kuò)增。多重分析產(chǎn)生每個(gè)外顯子正確大小的產(chǎn)物,。使用FailSafe PCR系統(tǒng)進(jìn)行一套反應(yīng)可成功地獲得擴(kuò)增自CFTR基因的5條PCR產(chǎn)物,。

總結(jié)：
    FailSafe PCR系統(tǒng)確保從各種模板（包括至少20kb長(zhǎng)度的長(zhǎng)序模板，富含GC的模板及多重PCR）成功地進(jìn)行PCR,。FailSafe PCR酶混合物的高保真性對(duì)于PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆,，表達(dá)及突變分析重要。該試劑盒方便地確保從任何模板進(jìn)行簡(jiǎn)單的一步擴(kuò)增,，而無需進(jìn)行繁瑣的條件優(yōu)化,，也不需對(duì)不同模板修改方法。這些優(yōu)點(diǎn)使得FailSafe PCR系統(tǒng)適于進(jìn)行常規(guī)及非常規(guī)的PCR擴(kuò)增,。

參考文獻(xiàn)：
1. Cline, J. et al. （1996） Nucl. Acids Res. 24（18）, 3546.
2. Fu, Y. H. et al. （1991） Cell 67（6）, 1047.
3. Richards, B. et al. （1993） Human Molecular Genetics 2（2）, 159.