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熒光western blot注意事項
點擊次數：3580 發(fā)布時間：2013-10-25
隨著熒光檢測的普及,，許多研究人員正考慮將western blot的檢測方法從化學發(fā)光轉到多重熒光。這一趨勢背后有多個推動力,。zui重要的是，熒光檢測能夠實現多重western blot分析,，每次能夠同時檢測幾個目標蛋白，而不再需要剝離和重新雜交,。熒光的其他好處在于動態(tài)范圍更寬、信號穩(wěn)定性更好,。
熒光blotting的小貼士
• 抗體濃度應當優(yōu)化,，在幾種不同稀釋度的抗體中孵育膜。選擇信噪比zui高的稀釋度,。
• 從化學發(fā)光轉到熒光檢測時,，一抗?jié)舛葢斣黾樱煌ǔ碚f是增加2-5倍,。二抗?jié)舛瓤赡芤残枰獌?yōu)化,；1:5,000稀釋是個不錯的起點。在使用特定抗體時,，可以參照生產商的建議,。
• 為了讓信噪比zui高，應使用自發(fā)熒光低的膜,，如 Immun-Blot® low fluorescence （LF） PVDF membrane,。
• 許多封閉液都成功用于熒光檢測。我們建議使用0.5-5% 酪蛋白,、zui多5%的脫脂奶粉,，或zui多3% BSA，溶于TTBS中,。
• 緩沖液中的顆?？赡芡Ａ粼谀ど希⒃斐蔁晒饧傧?。只使用高質量的試劑,，并對所有緩沖液過濾滅菌。
• 使用鈍的鑷子從邊緣操作,。避免劃破膜或弄皺,，這會在熒光檢測時造成假象。
• 使用鉛筆來標記膜,，因為許多墨水都會發(fā)出熒光,。
• 溴酚藍會發(fā)出熒光。確保染料與樣品已分開,，切掉凝膠上包含染料的部分,，或省掉樣品緩沖液中的溴酚藍。
• 無需在暗處開展免疫檢測,；正常的室內燈光不會使熒光標記的抗體發(fā)生光漂白,。不過，熒光標記抗體的儲液應保存在暗處。
• 在處理膜時,，使用無粉末的手套,，以避免膜上出現假象或指紋。
多重分析的小貼士
• 使用來自不同宿主的一抗（如小鼠和兔）,。兩個親緣關系相近物種的抗體（如大鼠和小鼠）通常會造成交叉反應,，即使抗體已經過交叉吸附。
• 使用經過交叉吸附的二抗,，以避免交叉反應,。
• 使用光譜上不同的熒光基團偶聯物，避免交叉通道熒光,。
• 在同時檢測多個目標之前,，單獨優(yōu)化每個目標的檢測。由于一些一抗并非很特異,，在膜上會產生多條帶,，故多重實驗之前的單目標檢測將有助于確定每個抗體的條帶模式。
• 大部分膜在波長較短的激發(fā)光下會顯示出較高的背景,。記住,，在藍色通道檢測zui強的目標，在綠色通道檢測中等目標,，而保留紅色通道來檢測zui弱的目標,。
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