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一般來講，耦聯(lián)到二抗上的探針主要有酶（辣根過氧化酶HRP和堿性磷酸酶AP或其衍生物APAAP,，PAP）,，熒光基團(tuán)（FITC, RRX, TR, PE, Rhodamine）和生物素。選用哪種探針的二抗主要取決于具體的實(shí)驗(yàn),。對于Western Blot和ELISA,，zui常用的二抗是酶標(biāo)二抗；而細(xì)胞或組織標(biāo)記實(shí)驗(yàn)（細(xì)胞免疫化學(xué),，組織免疫化學(xué),，流式細(xì)胞術(shù)）中通常使用熒光標(biāo)記的二抗。如果想要更 大程度的放大檢測信號,，可以使用Biotin/Avidin檢測系統(tǒng),。其中熒光素是具有光致熒光特性的染料，熒光染料種類很多,，目前常用于熒光標(biāo)記二抗有 以下幾種：
【異硫氰酸熒光素-Fluorescein Isothiocyanate （FITC）熒光標(biāo)記二抗】
FITC 純品為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末,，易溶于水和酒精溶劑。FITC分子量為389.4,，zui大吸收光波長為490～495nm,，zui大發(fā)射光波長為 520～530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光,。FITC在冷暗干燥處可保存多年,，是目前應(yīng)用zui廣泛的熒光素。由于FITC是小分子化合物,，每一個抗體可標(biāo)記 幾個FITC分子,，IgM通常用小分子的熒光素標(biāo)記，如FITC,、Cy3/5,、Texas Red等。FITC熒光二抗主要優(yōu)點(diǎn)是人眼對黃綠色較為敏感,，通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色,。然而FITC的zui大缺點(diǎn)是淬滅快，因此要和抗淬滅劑一起 使用,。
【四甲基異硫氰酸羅丹明-Tetramethyl Rhodamin Isothiocyanate（TRITC）,，Rhodamine Red-X（RRX）, Texas Red（TR）熒光標(biāo)記二抗】
這 些羅丹明的衍生物耦聯(lián)基團(tuán)具有不同的吸收波長 （550, 570, 596nm）和zui大發(fā)射波長（570, 590, 620nm）。盡管TRITC經(jīng)常和FITC一起在雙標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中使用,，使用RRX和TR可以得到更好的顏色區(qū)分,。在使用裝有氪氬燈的激光共聚焦掃描顯微鏡 作三標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)時,，RRX尤其有用，可以和Cy2（或者FITC）和Cy5一起使用,，因?yàn)镽RX的發(fā)射波長在Cy2和Cy5中間,，而且和這兩者覆蓋都很 少。氪氬燈激發(fā)光為488nm,，598nm和647nm,，分別是Cy2（FITC）, RRX和Cy5的理想激發(fā)波長。因?yàn)镕ITC和PE可以被氬燈的488nm波長激發(fā), 在流式細(xì)胞儀中用FITC作雙標(biāo),，另一種用藻紅蛋白（PE）耦聯(lián)基團(tuán)要比羅丹明好,。TRITC為羅丹明的衍生物，呈紫紅色粉末,，較穩(wěn)定,。zui大吸收光波長為 550nm，zui大發(fā)射光波長為620nm,，呈現(xiàn)橙紅色熒光,，與FITC的綠色熒光對比鮮明，可配合用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧?。因其熒光淬滅慢,，也可用于單?dú) 標(biāo)記染色。
【菁類染料-Cyanine dyes（Cy2, Cy3, Cy5）】
Cy2 耦聯(lián)基團(tuán)激發(fā)波長為492nm,，發(fā)光為波長510nm的綠色可見光,。Cy2和FITC使用相同的濾波片。由于Cy2比FITC在光下更穩(wěn)定,。要避免使用含 有磷酸化的苯二胺的封片劑,，因?yàn)檫@種抗淬滅劑和Cy2反應(yīng)，在染色片儲存后會導(dǎo)致熒光微弱和擴(kuò)散,。Cy3和Cy5比其他的熒光團(tuán)探針要更亮,，更穩(wěn)定，背景 更弱,。Cy3耦聯(lián)基團(tuán)激發(fā)光的zui大波長為550nm,，zui強(qiáng)發(fā)射光為570nm。因?yàn)榧ぐl(fā)光和發(fā)射光波長很接近TRITC, 在熒光顯微鏡中,，可使用和TRITC一樣的濾波片,。
Cy3在氬光燈（514nm或528nm）下可以被激發(fā)出50％的光強(qiáng)，在氦氖燈（543nm）或者汞燈（546nm）下則約
75％,。 Cy3可以和熒光素一起作雙標(biāo),。Cy3還可以和Cy5一起在共聚焦顯微鏡實(shí)驗(yàn)中作多標(biāo)記。Cy5耦聯(lián)基團(tuán)的激發(fā)波長zui大650nm,，發(fā)光波長zui大 670nm,。在氪氬燈（647nm）下它們可被激發(fā)出98％的熒光，在氦氖燈下（633nm）為63％,。Cy5可以和很多其他的熒光基團(tuán)一起用在多標(biāo)記的 實(shí)驗(yàn)中,。由于它的zui大發(fā)射波長在670nm，Cy5很難用裸眼觀察,，而且不能用汞燈作理想的激發(fā),。通常觀察Cy5時采用具有合適激發(fā)光和遠(yuǎn)紅外檢測器的共 聚焦顯微鏡。在水相封片劑中應(yīng)當(dāng)加入抗淬滅劑,。使用傳統(tǒng)的表面熒光顯微鏡時,，不推薦使用Cy5。
【藻紅蛋白或藻膽色素蛋白-Phycoerythrin（PE）熒光標(biāo)記二抗】
存 在于被稱為藻紅的多聚微粒中,，位于葉綠素的反應(yīng)中心,，在自然結(jié)構(gòu)中，藻紅蛋白吸收光能,，吸收后轉(zhuǎn)化成能量,，供其發(fā)育生長。當(dāng)藻紅蛋白被分離和純化后,，其蛋 白質(zhì)變得具有很強(qiáng)的熒光,，能吸收不同波長的光，發(fā)出亮紅色的熒光,，此時不再接受任何外來的光,，也不能轉(zhuǎn)移光能。藻紅蛋白PE的吸收波長范圍較廣,，zui大的吸 收波長為566nm,，zui大的發(fā)射波長為574nm。藻紅蛋白作為熒光標(biāo)記物具有以下優(yōu)點(diǎn)：首先具有強(qiáng)的長波長激發(fā)和發(fā)射熒光,，可避免來自其他生物材料熒光 的干擾,；并且具有*的發(fā)射量子產(chǎn)率；另外PE具有非常高的水溶性而且與許多生物學(xué)或合成材料的多位點(diǎn)穩(wěn)定交聯(lián),。
【Aminomethylcoumarin Acetate （AMCA）】
耦 聯(lián)的AMCA吸收光波長zui大為350nm,，發(fā)熒光則為450nm。對于熒光顯微鏡來說,，AMCA可以用汞燈來激發(fā),，用紫外濾板來觀察。由于AMCA的信號 相對較弱,，單標(biāo)實(shí)驗(yàn)中不推薦使用AMCA,。AMCA和熒光素的熒光波長只有很小的重疊范圍，而和發(fā)出長波長熒光的熒光基團(tuán)沒有或者只有極少的重疊，因此它 zui常用于多標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中,，比如免疫熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀,。由于人眼不能很好的檢測藍(lán)色熒光，在多標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)中,，AMCA耦聯(lián)的二抗應(yīng)當(dāng)被用于檢測大量的抗 原,。AMCA和熒光素一樣很快淬滅，使用抗淬滅劑可以減輕,。且由于肉眼不能很好的檢測AMCA所激發(fā)的藍(lán)色熒光,，因而AMCA耦聯(lián)的二抗更適用于檢測大量 存在的抗原。如果使用在流式細(xì)胞儀中,，AMCA可以用汞燈或者水冷卻的氬光燈激發(fā),，因?yàn)樗鼈儼l(fā)出的光線是在光譜的紫外區(qū)。
注：由于觀察熒光需要一 定波長的激發(fā)光,，必須根據(jù)實(shí)驗(yàn)室已有的儀器可發(fā)光的波段進(jìn)行選擇,。另外，多標(biāo)記中對探針色彩區(qū)分程度的要求,。例如,，若丹明紅-X （RRX）和德克薩斯紅（TR）熒光素的區(qū)別就比四甲基若丹明（TRITC）或者Cy3的區(qū)別明顯。如果對靈敏度有更高的要求,，則Cy3和Cy5就比其他 的熒光團(tuán)探針要亮,。
西美杰備有全面的二抗現(xiàn)貨產(chǎn)品并能提供zui完整的二抗產(chǎn)品線。主要二抗品牌為zui大的二抗和底物生產(chǎn)廠商KPL以及前沿抗體生 產(chǎn)商 ProteinTech,。針對熒光標(biāo)記二抗,，有FITC、TRITC,、Rhodamine,、PE、Cy3/5,、AMCA,、Dylight等多種熒光標(biāo)記二 抗；按照檢測物種分,，有抗人,、大鼠、小鼠,、豬,、驢、綿羊,、山羊,、小雞、馬、兔,、倉鼠,、狗、牛,，以及多種細(xì)菌類二抗,；另外,，還有IgG,、IgA、IgM以及 IgG（Fc）,、IgG（ab’）2等不同類型抗體,。