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熒光定量PCR熒光為基礎(chǔ)對核酸進行定量分析,,其應(yīng)用非常廣泛,,可以用于檢測基因的表達量(RNA的豐度),驗證表達譜芯片或轉(zhuǎn)錄組測序的數(shù)據(jù),,確定病原體的載量,,對片段的拷貝數(shù)(CNV)進行分析,對基因進行分型等等,。其原理為通過監(jiān)控反應(yīng)體系中熒光強度的變化,,記錄檢測熒光達到閾值時的循環(huán)數(shù)(Ct值)。從理論上說,,起始模板量和Ct值密切相關(guān),,因此我們通過判讀Ct值從而對樣本進行定量。熒光定量PCR從方法上來說可以分為染料法和探針法兩種,。
染料法
在國內(nèi),,染料法一般采用DNA染料SYBRGreenⅠ,染料法使用簡單,,成本也相對較低,,因此會有很多國內(nèi)研究者會選擇使用染料法進行后續(xù)實驗。在染料法熒光定量PCR實驗中,,染料能夠與雙鏈結(jié)合,,從而發(fā)光,而在游離狀態(tài)下,,SYBRGreen I發(fā)出微弱的熒光,。所以,一個反應(yīng)發(fā)出的全部熒光信號與出線的雙鏈DNA量呈比列,,且會隨擴增產(chǎn)物的增加而增加,。
但是染料法檢測的是體系中的所有雙鏈DNA,因此一些非特異性擴增或者引物二聚體的出現(xiàn),,會極大的影響真實結(jié)果的準(zhǔn)確性,。為此,一些廠商提供ROX作為內(nèi)部熒光參考標(biāo)準(zhǔn),,用來校正背景,,但是即便如此,染料法特異性的問題依舊無法與探針法相比,。另外染料法無法在同一個反應(yīng)中檢測多個目的片段,,對于復(fù)雜序列,如果難以擴增的話,,也會受到脫靶效應(yīng)(如引物二聚體)的影響,。在這種情況下,,就需要在實驗前期進行熔解曲線分析,,判斷擴增所得產(chǎn)物是否只有一種,。
TaqMan探針法
TaqMan探針法PCR擴增時,在加入一對擴增引物的同時再加入一個特異性的熒光探針,。Taqman探針為一段線性的寡核苷酸,,兩端分別標(biāo)記一個熒光報告基團(FAM或Hex等)和一個熒光淬滅基團,當(dāng)探針完整時,,報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收,,PCR儀檢測不到熒光信號;當(dāng)PCR擴增時(在延伸階段),,Taq酶的5' -3'外切酶活性將探針酶切降解,,使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離,從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號,,即每擴增一條DNA鏈,,就有一個熒光分子形成,實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR 產(chǎn)物形成*同步,,這也就是探針法定量的原理,。
探針法與染料法的較為大區(qū)別在于,理論上探針法中的熒光信號只來源于目標(biāo)序列,,也就是不受非特異性擴增及引物二聚體的影響,。除此之外,人們還可以利用不同探針,,在一個體系中使用不同的熒光標(biāo)記同時檢測多種指標(biāo),,達到節(jié)省實驗成本的目的。在樣本量比較大的情況下,,成本甚至可以低于染料法,。
因此我們可以看到,在選擇熒光定量實驗時,,探針法在特異性和準(zhǔn)確性方面遠遠優(yōu)于廉價的染料法,,但在實際使用時,TaqMan探針高昂的價格常常讓人望而卻步,。目前,,上海捷瑞生物工程有限公司在強大的探針合成能力的前提下,推出了探針法熒光定量PCR服務(wù),,以染料法的價格,,享受探針法的服務(wù),在相同的經(jīng)費情況下,,提高實驗的準(zhǔn)確性和特異性,。
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