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中級(jí)會(huì)員 | 第15年

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購(gòu)買(mǎi)熒光定量PCR儀是會(huì)遇到哪些誤區(qū)

時(shí)間:2012/7/2閱讀:4503
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在基因擴(kuò)增儀的幾種類(lèi)型中,,熒光定量PCR因操作方便,、運(yùn)行速度快、實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確,,受到越來(lái)越多的分子生物學(xué)研究者青睞,。實(shí)驗(yàn)者要購(gòu)買(mǎi)一款合適的熒光定量PCR,需要考慮各方面的因素,,首先要分析實(shí)驗(yàn)室目前乃至將來(lái)的需求,、平衡實(shí)驗(yàn)室的預(yù)算,更要詳細(xì)研究各種各樣的宣傳資料,。面對(duì)各種不同性能的產(chǎn)品,,我們?cè)撊绾芜x擇呢?首先建議大家走出認(rèn)識(shí)熒光定量PCR的兩個(gè)誤區(qū):

誤區(qū)一:熒光定量PCR無(wú)需梯度功能對(duì)于使用染料法的定量PCR反應(yīng),,雖然有各種各樣的PCR引物設(shè)計(jì)軟件或者經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算熔解溫度(Tm值),但運(yùn)用的公式不同,、引物序列不同,,Tm值的差異會(huì)很大。引物的熔解溫度決定了退火溫度,。而且模版中堿基的組合千變?nèi)f化,,對(duì)于特殊片斷,經(jīng)驗(yàn)公式得到的數(shù)據(jù)不一定能得出準(zhǔn)確的結(jié)果,,退火溫度細(xì)微的差異對(duì)結(jié)果都可能產(chǎn)生決定性的影響,,因而摸條件一度是讓人很頭疼的問(wèn)題。梯度PCR的出現(xiàn)部分解決了一些問(wèn)題——在反應(yīng)過(guò)程中每個(gè)孔的溫度控制條件可以在范圍內(nèi)按照梯度變化,,根據(jù)結(jié)果,,一步就可以摸索出較為適合的反應(yīng)條件,。不單是退火溫度,連變性溫度和延伸溫度都可以?xún)?yōu)化——對(duì)于多種聚合酶混合酶擴(kuò)增如Invitrogen,、Clontech,、Promega的多數(shù)高保真Taq酶來(lái)說(shuō)這個(gè)非常重要,因?yàn)?/span>Taq和校正酶的較為佳反應(yīng)溫度可能有顯著差異,,優(yōu)化延伸溫度就顯得很重要,。使用有梯度功能的熒光定量PCR可以一次完成以往多次實(shí)驗(yàn)才能完成的優(yōu)化過(guò)程,簡(jiǎn)化了摸索PCR反應(yīng)條件的繁瑣實(shí)驗(yàn),,既節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間提率,,又節(jié)省實(shí)驗(yàn)成本。

誤區(qū)二:儀器通道越多越好隨著PCR技術(shù)的成熟運(yùn)用,,多重?cái)U(kuò)增越來(lái)越熱鬧,,熒光定量PCR儀也不能幸免。從較為初ABI公司推出的單通道熒光定量PCR發(fā)展到如今各個(gè)廠家都推出4通道,、5通道甚至6通道熒光定量PCR儀,,眼花繚亂的選擇讓人無(wú)所適從,就有人一不小心走進(jìn)了通道越多越好的誤區(qū),。在使用有些廠家5通道的熒光定量?jī)x時(shí),,為了確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的性和準(zhǔn)確性都要在實(shí)驗(yàn)中使用ROX(一種熒光染料)或的Reference dye,這些熒光染料都必須單獨(dú)使用一個(gè)檢測(cè)通道,。所以,,真正能檢測(cè)多重PCR熒光信號(hào)的有效通道只有4個(gè),而且使用校正染料可能會(huì)增加后期的使用成本,。有的熒光定量PCR的檢測(cè)通道是只為自已廠家的的熒光染料或試劑開(kāi)放的,,有效檢測(cè)通道也絕非像宣傳資料中宣稱(chēng)的那么多。在購(gòu)買(mǎi)前確認(rèn)熒光定量PCR儀器的有效檢測(cè)通道尤為重要,,不能單單只聽(tīng)宣傳,。考慮多重?zé)晒舛?/span>PCR的通道數(shù)的時(shí)候也應(yīng)該從實(shí)驗(yàn)室實(shí)際情況出發(fā),,多重PCR并非人人適用,、人人可用,因?yàn)樗箤?shí)驗(yàn)復(fù)雜化了,。

當(dāng)我們看清誤區(qū),,在選擇一款較為適合自己需求的熒光定量PCR時(shí),我們又該關(guān)注些什么呢,?

1,、運(yùn)行速度在熒光定量PCR儀的眾多技術(shù)參數(shù)中,升降溫速度也是廠家喜歡大力宣傳的指標(biāo),。更快的升降溫,,可以縮短反應(yīng)進(jìn)行的時(shí)間,,而且縮短了可能的非特異性結(jié)合、反應(yīng)的時(shí)間,,提高PCR的特異性,。為了更好的完成實(shí)驗(yàn),各個(gè)廠家紛紛推出能快速運(yùn)行的熒光定量PCR儀,。例如ROCHE推出的Lightcycler2.0利用空氣動(dòng)力學(xué)原理,,可在半小時(shí)左右完成30-40個(gè)循環(huán)。ABI7500可以選配FAST模塊擁有5°C/秒的升降溫速度,,可在40分鐘左右完成30-40個(gè)循環(huán),。較為近eppendorf新推出的Mastercycler ep realplex4S2S的銀質(zhì)模塊熒光定量PCR儀,升降溫的速度可達(dá)到6/秒和4.5/秒,,是目前同類(lèi)產(chǎn)品中升降溫速度較為快的熒光定量PCR儀,。一個(gè)在其他儀器上原本需要40—60分鐘的PCR反應(yīng),eppendorf Mastercycler ep realplex4S2S (銀質(zhì)模塊只需運(yùn)行28分鐘——別小看這節(jié)約下來(lái)的幾十分鐘,,一天下來(lái)就可以多運(yùn)行好幾輪了,。

2、靈活性大規(guī)模繁忙的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備固然讓人羨慕,,但是常規(guī)實(shí)驗(yàn)室同樣可以有精彩的選擇?,F(xiàn)在的儀器供應(yīng)商擁有眾多技術(shù)專(zhuān)家,有的還能提供整個(gè)分子生物學(xué)的基礎(chǔ)研究平臺(tái),,不但了解,、滿(mǎn)足您現(xiàn)在的需求,而且還考慮到了你可能變化的需求——升級(jí)和更換模塊,。Bio-radMycycler就可以選擇模塊升級(jí)為定量PCR儀,。ABI7900可以選擇將96孔槽變?yōu)?/span>384孔槽。像離心式的雙通道的Rotor-gene3000A就可以根據(jù)您研究的需要升級(jí)成四通道的熒光定量PCR儀,。Eppendorf公司在這方面考慮的就更加周全,,如實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)擁有Mastercycler ep可以按照您的要求升級(jí)為Mastercycler ep realplex熒光定量PCR儀,而且可升級(jí)的型號(hào)有4種:2通道銀質(zhì),、鋁制模塊和4通道銀質(zhì),、鋁制模塊。您可以根據(jù)自己的經(jīng)費(fèi)和實(shí)驗(yàn)需要購(gòu)買(mǎi),、升級(jí)任何一款Mastercycler ep realplex熒光定量PCR儀。

3,、儀器的檢測(cè)通量在購(gòu)買(mǎi)定量PCR儀的時(shí)候要根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的需要來(lái)選擇不同通量的儀器,。目前市面上的熒光定量PCR的檢測(cè)通量小到16個(gè)多到384個(gè)。如果進(jìn)行一般的基因表達(dá)研究或病原體檢測(cè),,實(shí)在不必購(gòu)買(mǎi)昂貴的儀器,,96孔的通量足夠用,;需要尋找要新藥靶點(diǎn)和疾病標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)室可以考慮購(gòu)買(mǎi)384孔板的儀器。假如經(jīng)費(fèi)有限無(wú)法購(gòu)買(mǎi)384孔板儀器的實(shí)驗(yàn)室,,可以考慮購(gòu)買(mǎi)運(yùn)行速度快(帶有FAST模塊)的96孔板熒光定量PCR儀,。有了高通量的儀器,你會(huì)發(fā)現(xiàn)樣品的制備和小體系,、多樣本的PCR體系構(gòu)建成為限制實(shí)驗(yàn)速度和結(jié)果的頸瓶,。

4、硬件設(shè)計(jì)特點(diǎn)熒光定量PCR儀主要有傳統(tǒng)的96孔板式,、創(chuàng)新的離心式等,,每種設(shè)計(jì)都有它的獨(dú)到之處但也都有無(wú)法避免的缺憾。傳統(tǒng)的96孔板的熒光定量PCR可以容納的樣本量大,,而且無(wú)需特殊的耗材,。有些傳統(tǒng)的96孔板的儀器采用鹵鎢燈激發(fā)、CCD檢測(cè),,這些光學(xué)結(jié)構(gòu)在96孔板的頂部,,每個(gè)樣品孔距光源和檢測(cè)器的光程各不相同——邊緣效應(yīng),對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響,。為了保證,、準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,這類(lèi)儀器在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中通常會(huì)使用ROX(一種熒光染料)或的Reference dye作為參照校正實(shí)驗(yàn)結(jié)果,。鹵鎢燈的使用壽命短,、更換成本較高已經(jīng)成為很多用戶(hù)頭痛的問(wèn)題。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中鹵鎢燈作為一種熱光源,,產(chǎn)生較多熱能對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有一定的影響,。CCD較為大的優(yōu)點(diǎn)就是可以同時(shí)掃描所有樣品中的熒光信號(hào),但是靈敏度較低,,而且同時(shí)檢測(cè)樣品間的熒光信號(hào)存在干擾,。像ABIBio-rad公司生產(chǎn)的熒光定量PCR就屬于這一種,。但Bio-radIQ系列熒光定量PCR帶有梯度功能,。創(chuàng)新的離心式的儀器通常選用LED激發(fā)、PMT檢測(cè),,離心式的設(shè)計(jì)上避免了邊緣效應(yīng),。LED光源是冷光源對(duì)實(shí)驗(yàn)沒(méi)有影響,因此無(wú)需采用其他熒光染料校正儀器,,而且使用壽命長(zhǎng)無(wú)需經(jīng)常更換,。PMT每次只能收集單個(gè)熒光信號(hào),但是檢測(cè)靈敏度高,。但這類(lèi)儀器運(yùn)行速度非???,但也存在樣本量小、耗材昂貴,、沒(méi)有梯度功能,、存在時(shí)間積分等缺點(diǎn)。CorbettRotor-gene系列和RocheLightcycler系列均為這一類(lèi)儀器,。隨著熒光定量PCR技術(shù)的使用,,聰明的儀器生產(chǎn)商紛紛在傳統(tǒng)的96孔板儀器上大作改進(jìn)。首先是StratageneMx3000p在檢測(cè)上突破了使用CCD改用PMT檢測(cè)熒光信號(hào),,大大提高了實(shí)驗(yàn)的靈敏度,,但激發(fā)光源仍然沿用傳統(tǒng)的鹵鎢燈并且沒(méi)有梯度功能。Eppendorf公司推出的Mastercycler ep realplex是一款帶有梯度功能的熒光定量PCR儀,,使用了96個(gè)LED為激發(fā)光源,,采用**的CPM(第二代PMT)及96合一光纖為檢測(cè)系統(tǒng),不但避免了邊緣效應(yīng)還保證所有樣品間的熒光信號(hào)沒(méi)有干擾,。 

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