在基因擴增儀的幾種類型中,，熒光定量PCR因操作方便、運行速度快,、實驗結(jié)果準確,，受到越來越多的分子生物學研究者青睞。實驗者要購買一款合適的熒光定量PCR,，需要考慮各方面的因素,，首先要分析實驗室目前乃至將來的需求、平衡實驗室的預算,，更要詳細研究各種各樣的宣傳資料,。面對各種不同性能的產(chǎn)品，我們該如何選擇呢,？首先建議大家走出認識熒光定量PCR的兩個誤區(qū)：

誤區(qū)一：熒光定量PCR儀無需梯度功能對于使用染料法的定量PCR反應(yīng),，雖然有各種各樣的PCR引物設(shè)計軟件或者經(jīng)驗公式計算熔解溫度（Tm值），但運用的公式不同,、引物序列不同,，Tm值的差異會很大。引物的熔解溫度決定了退火溫度,。而且模版中堿基的組合千變?nèi)f化,，對于特殊片斷，經(jīng)驗公式得到的數(shù)據(jù)不一定能得出準確的結(jié)果,，退火溫度細微的差異對結(jié)果都可能產(chǎn)生決定性的影響,，因而“摸條件”一度是讓人很頭疼的問題。梯度PCR的出現(xiàn)部分解決了一些問題——在反應(yīng)過程中每個孔的溫度控制條件可以在范圍內(nèi)按照梯度變化,，根據(jù)結(jié)果,，一步就可以摸索出較為適合的反應(yīng)條件。不單是退火溫度,，連變性溫度和延伸溫度都可以優(yōu)化——對于多種聚合酶混合酶擴增如Invitrogen,、Clontech、Promega的多數(shù)高保真Taq酶來說這個非常重要,，因為Taq和校正酶的較為佳反應(yīng)溫度可能有顯著差異,，優(yōu)化延伸溫度就顯得很重要。使用有梯度功能的熒光定量PCR可以一次完成以往多次實驗才能完成的優(yōu)化過程,，簡化了摸索PCR反應(yīng)條件的繁瑣實驗,，既節(jié)省實驗時間提率，又節(jié)省實驗成本,。

誤區(qū)二：儀器通道越多越好隨著PCR技術(shù)的成熟運用,，多重擴增越來越熱鬧,，熒光定量PCR儀也不能幸免,。從較為初ABI公司推出的單通道熒光定量PCR儀發(fā)展到如今各個廠家都推出4通道,、5通道甚至6通道熒光定量PCR儀，眼花繚亂的選擇讓人無所適從,，就有人一不小心走進了“通道越多越好”的誤區(qū),。在使用有些廠家5通道的熒光定量儀時，為了確保實驗結(jié)果的性和準確性都要在實驗中使用ROX（一種熒光染料）或的Reference dye,，這些熒光染料都必須單獨使用一個檢測通道,。所以，真正能檢測多重PCR熒光信號的有效通道只有4個,，而且使用校正染料可能會增加后期的使用成本,。有的熒光定量PCR的檢測通道是只為自已廠家的的熒光染料或試劑開放的，有效檢測通道也絕非像宣傳資料中宣稱的那么多,。在購買前確認熒光定量PCR儀器的有效檢測通道尤為重要,，不能單單只聽宣傳?？紤]多重熒光定量PCR的通道數(shù)的時候也應(yīng)該從實驗室實際情況出發(fā),，多重PCR并非人人適用、人人可用,，因為它使實驗復雜化了,。

當我們看清誤區(qū)，在選擇一款較為適合自己需求的熒光定量PCR儀時,，我們又該關(guān)注些什么呢,？

1、運行速度在熒光定量PCR儀的眾多技術(shù)參數(shù)中,，升降溫速度也是廠家喜歡大力宣傳的指標,。更快的升降溫，可以縮短反應(yīng)進行的時間,，而且縮短了可能的非特異性結(jié)合,、反應(yīng)的時間，提高PCR的特異性,。為了更好的完成實驗,，各個廠家紛紛推出能快速運行的熒光定量PCR儀。例如ROCHE推出的Lightcycler2.0利用空氣動力學原理,，可在半小時左右完成30-40個循環(huán),。ABI的7500可以選配FAST模塊擁有5°C/秒的升降溫速度，可在40分鐘左右完成30-40個循環(huán),。較為近eppendorf新推出的Mastercycler ep realplex4S和2S的銀質(zhì)模塊熒光定量PCR儀,，升降溫的速度可達到6℃/秒和4.5/秒，是目前同類產(chǎn)品中升降溫速度較為快的熒光定量PCR儀。一個在其他儀器上原本需要40—60分鐘的PCR反應(yīng),，eppendorf Mastercycler ep realplex4S和2S （銀質(zhì)模塊）只需運行28分鐘——別小看這節(jié)約下來的幾十分鐘,，一天下來就可以多運行好幾輪了。

2,、靈活性大規(guī)模繁忙的實驗室設(shè)備固然讓人羨慕,，但是常規(guī)實驗室同樣可以有精彩的選擇。現(xiàn)在的儀器供應(yīng)商擁有眾多技術(shù)專家,，有的還能提供整個分子生物學的基礎(chǔ)研究平臺,，不但了解、滿足您現(xiàn)在的需求,，而且還考慮到了你可能變化的需求——升級和更換模塊,。Bio-rad的Mycycler就可以選擇模塊升級為定量PCR儀。ABI的7900可以選擇將96孔槽變?yōu)?/span>384孔槽,。像離心式的雙通道的Rotor-gene3000A就可以根據(jù)您研究的需要升級成四通道的熒光定量PCR儀,。Eppendorf公司在這方面考慮的就更加周全，如實驗室已經(jīng)擁有Mastercycler ep可以按照您的要求升級為Mastercycler ep realplex熒光定量PCR儀,，而且可升級的型號有4種：2通道銀質(zhì),、鋁制模塊和4通道銀質(zhì)、鋁制模塊,。您可以根據(jù)自己的經(jīng)費和實驗需要購買,、升級任何一款Mastercycler ep realplex熒光定量PCR儀。

3,、儀器的檢測通量在購買定量PCR儀的時候要根據(jù)實驗室的需要來選擇不同通量的儀器,。目前市面上的熒光定量PCR的檢測通量小到16個多到384個。如果進行一般的基因表達研究或病原體檢測,，實在不必購買昂貴的儀器,，96孔的通量足夠用；需要尋找要新藥靶點和疾病標記的實驗室可以考慮購買384孔板的儀器,。假如經(jīng)費有限無法購買384孔板儀器的實驗室,，可以考慮購買運行速度快（帶有FAST模塊）的96孔板熒光定量PCR儀。有了高通量的儀器,，你會發(fā)現(xiàn)樣品的制備和小體系,、多樣本的PCR體系構(gòu)建成為限制實驗速度和結(jié)果的頸瓶。

4,、硬件設(shè)計特點熒光定量PCR儀主要有傳統(tǒng)的96孔板式,、創(chuàng)新的離心式等，每種設(shè)計都有它的獨到之處但也都有無法避免的缺憾,。傳統(tǒng)的96孔板的熒光定量PCR可以容納的樣本量大,，而且無需特殊的耗材,。有些傳統(tǒng)的96孔板的儀器采用鹵鎢燈激發(fā)、CCD檢測,，這些光學結(jié)構(gòu)在96孔板的頂部,，每個樣品孔距光源和檢測器的光程各不相同——邊緣效應(yīng)，對結(jié)果產(chǎn)生影響,。為了保證、準確的實驗結(jié)果,，這類儀器在實驗過程中通常會使用ROX（一種熒光染料）或的Reference dye作為參照校正實驗結(jié)果,。鹵鎢燈的使用壽命短、更換成本較高已經(jīng)成為很多用戶頭痛的問題,。在實驗過程中鹵鎢燈作為一種熱光源,，產(chǎn)生較多熱能對實驗結(jié)果有一定的影響。CCD較為大的優(yōu)點就是可以同時掃描所有樣品中的熒光信號,，但是靈敏度較低,，而且同時檢測樣品間的熒光信號存在干擾。像ABI,、Bio-rad公司生產(chǎn)的熒光定量PCR就屬于這一種,。但Bio-rad的IQ系列熒光定量PCR帶有梯度功能。創(chuàng)新的離心式的儀器通常選用LED激發(fā),、PMT檢測,，離心式的設(shè)計上避免了邊緣效應(yīng)。LED光源是冷光源對實驗沒有影響,，因此無需采用其他熒光染料校正儀器,，而且使用壽命長無需經(jīng)常更換。PMT每次只能收集單個熒光信號,，但是檢測靈敏度高,。但這類儀器運行速度非常快,，但也存在樣本量小,、耗材昂貴、沒有梯度功能,、存在時間積分等缺點,。Corbett的Rotor-gene系列和Roche的Lightcycler系列均為這一類儀器。隨著熒光定量PCR技術(shù)的使用,，聰明的儀器生產(chǎn)商紛紛在傳統(tǒng)的96孔板儀器上大作改進,。首先是Stratagene的Mx3000p在檢測上突破了使用CCD改用PMT檢測熒光信號，大大提高了實驗的靈敏度,，但激發(fā)光源仍然沿用傳統(tǒng)的鹵鎢燈并且沒有梯度功能,。Eppendorf公司推出的Mastercycler ep realplex是一款帶有梯度功能的熒光定量PCR儀,，使用了96個LED為激發(fā)光源，采用**的CPM（第二代PMT）及96合一光纖為檢測系統(tǒng),，不但避免了邊緣效應(yīng)還保證所有樣品間的熒光信號沒有干擾,。 

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