4 PCR反應特點

4.1特異性強   
PCR反應的特異性決定因素為：
①引物與模板DNA特異正確的結合,；
②堿基配對原則,；
③Taq DNA聚合酶合成反應的忠實性；
④靶基因的特異性與保守性,。
4.2 靈敏度高
PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的,，能將皮克(pg=10^-12)量級的起始待測模板擴增到微克(μg=10^-6)水平。能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞,；在病毒的檢測中,，PCR的靈敏度可達3個RFU(空斑形成單位)；在細菌學中最小檢出率為3個細菌。
4.3簡便,、快速
PCR反應用耐高溫的Taq DNA聚合酶,，一次性地將反應液加好后，經(jīng)過變性-退火-延伸反應,，一般在2～4 小時完成擴增反應。擴增產(chǎn)物一般用電泳分析,，不一定要用同位素,，無放射性污染、易推廣,。
4.4 對標本的純度要求低
不需要分離病毒或細菌及培養(yǎng)細胞,，DNA粗制品及RNA均可作為擴增模板?？芍苯佑门R床標本如血液,、體腔液、洗嗽液,、毛發(fā),、細胞、活組織等DNA擴增檢測,。

5 PCR常見問題

5.1假陰性,，不出現(xiàn)擴增條帶
PCR反應的關鍵環(huán)節(jié)有：
（1）模板核酸的制備
①模板中含有雜蛋白質(zhì)；
②模板中含有Taq酶抑制劑,；
③模板中蛋白質(zhì)沒有消 化除凈,，特別是染色體中的組蛋白；
④在提取制備模板時丟失過多,，或吸入酚,；
⑤模板核酸變性不底。在酶和引物質(zhì)量好時,，不出現(xiàn)擴增帶,，極有可能是標本
的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病,，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液,，
其程序亦應固定不宜隨意更改。
（2）引物的質(zhì)量與特異性
引物質(zhì)量,、引物的濃度,、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條
帶不理想,、容易彌散的常見原因,。有些批號的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一
條濃度高，一條濃度低,，造成低效率的不對稱擴增,，對策為：
①選定一個好的引物合成單位。
②引物的濃度不僅要看OD值,，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳,，一定要有
引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應大體一致,，如一條引物有條帶,，一條引物
無條帶，此時做PCR有可能失敗,，應和引物合成單位協(xié)商解決,。如一條引物亮度
高，一條亮度低,，在稀釋引物時要平衡其濃度,。
③引物應高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分,，導致引物
變質(zhì)降解失效,。
④引物設計不合理，如引物長度不夠,，引物之間形成二聚體等,。
（3）酶的質(zhì)量
             酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用,，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導致假陰性,。需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。
（4）Mg²⁺濃度
Mg²⁺離子濃度對PCR擴增效率影響很大,，濃度過高可降低PCR擴增的特異
性,，濃度過低則影響PCR擴增產(chǎn)量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。
（5）反應體積的改變
通常進行PCR擴增采用的體積為20ul,、30ul,、50ul或100ul，應用多大體積
進行PCR擴增,，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設定,，在做小體積如20ul 后，
再做大體積時,，一定要模索條件,，否則容易失敗。
（6）物理原因
變性對PCR擴增來說相當重要,，如變性溫度低,，變性時間短,，極有可能出現(xiàn)
假陰性；退火溫度過低,，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高
影響引物與模板的結合而降低PCR擴增效率,。有時還有必要用標準的溫度計,，檢
測一下擴增儀或水溶鍋內(nèi)的變性,、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一,。
（7）靶序列變異
如靶序列發(fā)生突變或缺失,，影響引物與模板特異性結合,，或因靶序列某段缺
失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的,。
5.2 假陽性
　　    出現(xiàn)的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊,，亮度更高,。
　　   （1）引物設計不合適
選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時,，
擴增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列,。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假
陽性,。需重新設計引物,。
　　   （2）靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染
這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導致假陽性,。
這種假陽性可用以下方法解決：操作時應小心輕柔,，防止將靶序列吸入加樣槍
內(nèi)或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外,，所有試劑或器材均應高壓消
毒,。所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。必要時,，在加標本前,，反應管
和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸,。二是空氣中的小片段核酸污染,，這
些小片段比靶序列短，但有一定的同源性,?？苫ハ嗥唇樱c引物互補后,，可擴
增出PCR產(chǎn)物,，而導致假陽性的產(chǎn)生,，可用巢式PCR方法來減輕或消除。
5.3 出現(xiàn)非特異性擴增帶
　　       非特異性條帶的出現(xiàn),，其原因：一是引物與靶序列不全互補,、 或引物聚合形成二聚體。二是Mg²⁺離子濃度過高,、退火溫度過低,，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關。其次是酶的質(zhì)和量,，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn),，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴增。對策有：
①必要時重新設計引物,；
②減低酶量或調(diào)換另一來源的酶,；
③降低引物量，適當增加模板量,，減少循環(huán)次數(shù),；
④適當提高退火溫度或采用二溫度點法(93℃變性，65℃左右退火與延伸),。
5.4出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶
　　       PCR擴增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶,。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過高,，Mg²⁺濃度過高,，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起,。對策為：
①減少酶量,，或調(diào)換另一來源的酶。
②減少dNTP的濃度,。適當降低Mg²⁺濃度,。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù),。