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pcr應(yīng)用中確認(rèn)RNA的質(zhì)量常用的三種方法

時間：2021/3/28閱讀：4527

實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)是通過測定RNA的轉(zhuǎn)錄水平來評估基因的活力,。RNA樣本提取的質(zhì)量直接影響基因表達(dá)分析,。影響RNA品質(zhì)的因素有以下三種：RNA濃度、RNA純度和RNA完整性。

檢測RNA濃度、純度和完整性的方式主要有以下幾種：

紫外分光光度計(jì)法：

測量260nm吸收值計(jì)算RNA濃度,，測量260nm/280nm吸收值的比值，用于評估RNA純度,。需要注意的是：在檢測核酸物質(zhì)時應(yīng)該在固定的PH溶液中進(jìn)行,。

260nm/280nm的比值范圍在 1.9~2.1 之間。＜1.9,，說明有蛋白質(zhì)殘留,；＞2.1，說明RNA可能發(fā)生降解,。

瓊脂糖凝膠電泳：

完整的RNA通常有三條帶,，最亮的是28S條帶，其次是18S條帶,，最淡的是5S條帶（部分試劑盒提取時會過濾掉5S條帶）,。通過瓊脂糖凝膠電泳可以檢測28S和18S的比值。該方法主要用于檢測RNA的純度和完整性,。

如果28S和18S條帶明亮,、清晰,、條帶銳利,，28S的亮度在18S條帶的兩倍以上，我們認(rèn)為RNA的質(zhì)量好,。

若RNA條帶出現(xiàn)彌散,，原因可能：RNA被核酸酶降解、電壓或電流過大,、上樣量過高或過低等,。

上述兩種方法在實(shí)驗(yàn)室比較常用，此外還有幾種檢測方式供大家選擇,。

熒光染料檢測：

通過熒光染料和RNA結(jié)合,，熒光活性增強(qiáng),。此方法的靈敏度較高，主要用于檢測RNA的濃度,。

微毛細(xì)管電泳：

可使用軟件的RIN（RNA Integrity Number）分?jǐn)?shù)評估,，10為RNA完整性好，0為最差,。此方法的靈敏度和分辨率較高,，可用于檢測RNA濃度、純度和完整性,。

3’-5’完整性檢測：

是在一個RNA樣本中檢測GAPDH mRNA的完整性來代表所有RNA的完整性,，主要用于檢測RNA的完整性。

得到高品質(zhì)RNA的小建議：

1,、盡量避免RNA酶污染,，使用無RNA酶的耗材和試劑，建議將擴(kuò)增前后的場所分開,。

2,、盡量減少采樣時間，樣品處理后快速冷凍,，可以加入RNA保護(hù)劑,。

3、RNA提取過程中可以使用RNA酶抑制劑,。

4,、存儲過程中避免反復(fù)凍融。

pcr應(yīng)用中確認(rèn)RNA的質(zhì)量常用的三種方法

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