實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是通過(guò)測(cè)定RNA的轉(zhuǎn)錄水平來(lái)評(píng)估基因的活力,。RNA樣本提取的質(zhì)量直接影響基因表達(dá)分析,。影響RNA品質(zhì)的因素有以下三種：RNA濃度,、RNA純度和RNA完整性。

檢測(cè)RNA濃度,、純度和完整性的方式主要有以下幾種：

紫外分光光度計(jì)法：

測(cè)量260nm吸收值計(jì)算RNA濃度,，測(cè)量260nm/280nm吸收值的比值，用于評(píng)估RNA純度,。需要注意的是：在檢測(cè)核酸物質(zhì)時(shí)應(yīng)該在固定的PH溶液中進(jìn)行,。

260nm/280nm的比值范圍在 1.9~2.1 之間。＜1.9,，說(shuō)明有蛋白質(zhì)殘留,；＞2.1，說(shuō)明RNA可能發(fā)生降解,。

瓊脂糖凝膠電泳：

完整的RNA通常有三條帶,，最亮的是28S條帶，其次是18S條帶,，最淡的是5S條帶（部分試劑盒提取時(shí)會(huì)過(guò)濾掉5S條帶）,。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳可以檢測(cè)28S和18S的比值。該方法主要用于檢測(cè)RNA的純度和完整性,。

如果28S和18S條帶明亮,、清晰、條帶銳利,，28S的亮度在18S條帶的兩倍以上,，我們認(rèn)為RNA的質(zhì)量好。

若RNA條帶出現(xiàn)彌散,，原因可能：RNA被核酸酶降解,、電壓或電流過(guò)大、上樣量過(guò)高或過(guò)低等,。

上述兩種方法在實(shí)驗(yàn)室比較常用,，此外還有幾種檢測(cè)方式供大家選擇,。

熒光染料檢測(cè)：

通過(guò)熒光染料和RNA結(jié)合，熒光活性增強(qiáng),。此方法的靈敏度較高,，主要用于檢測(cè)RNA的濃度。

微毛細(xì)管電泳：

可使用軟件的RIN（RNA Integrity Number）分?jǐn)?shù)評(píng)估,，10為RNA完整性好,，0為最差。此方法的靈敏度和分辨率較高,，可用于檢測(cè)RNA濃度,、純度和完整性。

3’-5’完整性檢測(cè)：

是在一個(gè)RNA樣本中檢測(cè)GAPDH mRNA的完整性來(lái)代表所有RNA的完整性,，主要用于檢測(cè)RNA的完整性,。

得到高品質(zhì)RNA的小建議：

1、盡量避免RNA酶污染,，使用無(wú)RNA酶的耗材和試劑,，建議將擴(kuò)增前后的場(chǎng)所分開(kāi)。

2,、盡量減少采樣時(shí)間,，樣品處理后快速冷凍，可以加入RNA保護(hù)劑,。

3,、RNA提取過(guò)程中可以使用RNA酶抑制劑。

4,、存儲(chǔ)過(guò)程中避免反復(fù)凍融,。