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當(dāng)前位置:上海旦鼎國際貿(mào)易有限公司>>技術(shù)文章>>上海旦鼎 流式細胞計的調(diào)試和使用
(1)調(diào)試和校準(zhǔn):流式細胞計在使用前,甚至在使用過程中都要精心進行調(diào)試,,以保證工作的可靠性和佳性,。調(diào)試的項目主要是激光強度、液流速度和測量區(qū)的光路等,。
激光強度:除調(diào)整反射鏡的角度以調(diào)整到所需波長的激光出光外,,還要結(jié)合顯示屏上的光譜曲線使激光的強度輸出為大。
液流速度:可通過操作臺數(shù)字顯示監(jiān)督,,調(diào)節(jié) 氣體壓力大小以獲得穩(wěn)定的液流速度,。
測量區(qū)光路調(diào)節(jié) :這是調(diào)試工作的關(guān)鍵。需要保證在測量區(qū)的液流,、激光束,、90。散射測量光電系統(tǒng)垂直正交,,而且交點較小,。一般可在用標(biāo)準(zhǔn)熒光微球等校準(zhǔn)中完成。
流式細胞術(shù)中所測得的量是相對值,,因此需要在使用前或使用中對系統(tǒng)進行校準(zhǔn)或標(biāo)定,,這樣才能通過相對測量獲得的意義。因而FCM中的校準(zhǔn)具有雙重功能:儀器的準(zhǔn)直調(diào)整和定量標(biāo)度,。標(biāo)準(zhǔn)樣品應(yīng)該穩(wěn)定,有形成份形狀應(yīng)是大小比較一致球形,,樣品分散性能良好,,且經(jīng)濟、容易獲得,。常用標(biāo)準(zhǔn)熒光微球作為非生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)樣品,,雞血紅細胞做為生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)樣品。微球用樹脂材料制作,,或標(biāo)有熒光素,,或不標(biāo)記熒光素。Flow Cytometry Stands公司可提供熒光強度藥盒,,在免疫實驗中可用來作為定
熒光標(biāo)準(zhǔn)來測定每個細胞所標(biāo)記的抗原位點數(shù)目,。所用的雞血紅細胞標(biāo)準(zhǔn)樣品制作過程昭下:取3.8%枸櫞酸或肝素抗凝的雞血(抗凝劑:雞血=1:4),經(jīng)PBS清洗3次,,再用5~10ml的1.0%戊二醛與清洗后的雞紅細胞混合,,室溫下振蕩醛化24h,后經(jīng)PBS再清洗,,貯4℃冰箱中備用,。需要指出的是因為未經(jīng)熒光染色,所測光信號為雞血紅蛋白的自發(fā)熒光,。
?。?)儀器的操作和使用:
①打開電源,,對系統(tǒng)進行預(yù)熱,;
②打開氣體閾,,調(diào)節(jié) 壓力,,獲得適宜的液流速度;開啟光源冷卻系統(tǒng);
?、墼跇悠饭苤屑尤肴ルx子水,,沖洗液流的噴嘴系統(tǒng);
?、芾眯?zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)樣品,,調(diào)整儀器,使在激光功率,、光電倍增管電壓,、放大器電路增益調(diào)定的基礎(chǔ)上,0,。和90,。散射的熒光強度強,并要求變異系數(shù)為??;
⑤選定流速,、測量細胞數(shù)、測量參數(shù)等,,在同樣的工作條件下測量樣品和對照樣品;同時選擇計算機屏上數(shù)據(jù)的顯示方式,,從而能直觀掌握測量進程,;
⑥樣品測量完畢后,,再用去離子水沖洗液流系統(tǒng);
?、咭驗閷嶒灁?shù)據(jù)已存入計算機硬盤(有的機器還備有光盤系統(tǒng),,存貯量更大),因此可關(guān)閉氣體,、測量裝置,而單獨使用計算機進行數(shù)據(jù)處理,;
?、鄬⑺杞Y(jié)果打印出來,。
在操作和使用中一定要注意如下事項:
1)光電倍增管要求穩(wěn)定的工作條件,暴露的較強的光線下以后,,需要較長時間的“暗適應(yīng)”以消除或降低部分暗電流本底才能工作,;另外還要注意磁屏蔽,;
2)光源不得在短時間內(nèi)(一般要1h左右)關(guān)上又打開,;使用光源必須預(yù)熱并注意冷卻系統(tǒng)工作是否正常,;
3)液流系統(tǒng)必需隨時保持液流暢通,避免氣泡栓塞,,所使用的鞘流液使用前要經(jīng)過過濾、消毒,;
4)注意根據(jù)測量對象的變換選用合適的濾片系統(tǒng),、放大器的類型等,;
5)特別強度每次測量都需要對照組。
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