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當(dāng)前位置:上海旦鼎國(guó)際貿(mào)易有限公司>>技術(shù)文章>>上海旦鼎 流式細(xì)胞儀使用方法
一.開(kāi)機(jī)程序
1.檢查穩(wěn)壓器電源,,打開(kāi)電源,穩(wěn)定5分鐘,。
2.打開(kāi)儲(chǔ)液箱,,倒掉廢液,
并在廢液桶中加入400ml漂白水原液,。打開(kāi)壓力閥,,取出鞘液桶,將鞘液桶加至4/5滿(一般可用三蒸水,,做分選必須用PBS或FACSFlow),,合上壓力閥。確實(shí)蓋緊桶蓋,,檢查所有管路是否妥善安置,。
3.將FACSCalibur開(kāi)關(guān)打開(kāi),,此時(shí)儀器功能控制鈕的顯示應(yīng)是STANDBY,預(yù)熱5-10分鐘,。排出過(guò)濾器內(nèi)的氣泡,。
4.如果需要打印,打開(kāi)打印機(jī)電源,。
5.打開(kāi)電腦,等待屏幕顯示出標(biāo)準(zhǔn)的蘋果標(biāo)志,。
6.執(zhí)行儀器PRIME功能一次,以排除Flow cell中的氣泡,。
7.分析樣品時(shí),,先用FACAFlow 或PBS進(jìn)行HIGH RUN約2分鐘。
做過(guò)分選后,,每次開(kāi)機(jī)后需沖洗管道:向分選裝置上裝上兩個(gè)50ml離心管,,不接通濃縮系統(tǒng),摁下右下角白色按鈕開(kāi)始沖洗,。待自動(dòng)停止
后接通濃縮裝置,,同上法沖洗一次。
二.預(yù)設(shè)獲取模式文件(Acquisition Template Files)
1.從蘋果標(biāo)志中選擇CELLQuest見(jiàn)一個(gè)新視窗,,可利用此視窗編輯一個(gè)獲取模式文件,。
2.選取屏幕左列繪圖工具中的Dot plot,繪出一個(gè)或多個(gè)Dot Plots(點(diǎn)圖),。從Dot Plot對(duì)話框中選取Acquisition作為圖形資料來(lái)源,,并確定適當(dāng)?shù)膞軸和y軸參數(shù)。
3.選取屏幕左列繪圖工具中的Histogram,,同上法可繪出Histogram(直方圖),。
4.將此視窗命名后儲(chǔ)存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuest Folder \EXP文件夾中,下次進(jìn)行相同實(shí)驗(yàn)時(shí)可直接調(diào)用,。
本計(jì)算機(jī)中已設(shè)定兩個(gè)模式文件:ACQ和EXP,,儲(chǔ)存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuest \EXP文件夾中,ACQ用于細(xì)胞DNA檢測(cè),,EXP用于細(xì)胞表面標(biāo)志分析,。
三.用CELLQuest進(jìn)行儀器的設(shè)定和調(diào)整
1.從蘋果畫面中選取CELLQuest,進(jìn)入CELLQuest后在File指令欄中打開(kāi)合適的獲取模式文件,。
2.從屏幕上方Acquire指令欄中,,選取Connect to Cytometer(快捷鍵: +B)進(jìn)行電腦和儀器的連機(jī)。將出現(xiàn)的Acquisiton Control對(duì)話框移至合適位置,。
3.從Cytometer指令欄中,,開(kāi)啟Detectors/Amps、Threshold、Compensation,、Status等四個(gè)對(duì)話框,,并將它們移至屏幕右方,以便獲取數(shù)據(jù)時(shí)隨時(shí)調(diào)整獲取條件,。也可以用 +1,,2,3,,4獲得此四個(gè)對(duì)話框。
4.在Detectors/Amps對(duì)話框中,,先為每個(gè)參數(shù)選擇適當(dāng)?shù)谋对瞿J?amplifier mode):線性模式Lin或?qū)?shù)模式Log,。一般進(jìn)行細(xì)胞表面抗原分析如分析外周血的淋巴細(xì)胞亞群時(shí),F(xiàn)SC和SSC多以線性模式Lin測(cè)量,,且DDM Param選擇FL2,,而FL1, FL2與FL3則以對(duì)數(shù)模式Log測(cè)量;分析細(xì)胞DNA含量時(shí),,F(xiàn)SC,,SSC,F(xiàn)L1,,F(xiàn)L2,,F(xiàn)L3皆以Lin進(jìn)行測(cè)量,且DDM Param選擇FL2,;分析血小板表型時(shí),,F(xiàn)SC,SSC,,F(xiàn)L1,,F(xiàn)L2,F(xiàn)L3等均以Log進(jìn)行測(cè)量,。
5.放上待檢測(cè)的樣品,,將流式細(xì)胞儀設(shè)定于RUN,流速可在HIGH 或LOW上,。
6.在Acquisiton
Control對(duì)話框中,,選取Acquire,開(kāi)始獲取細(xì)胞,。在以下的儀器調(diào)整過(guò)程中隨時(shí)選取Pause,,Restart以觀察調(diào)整效果。未*調(diào)整好之前不要去掉SETUP前的“?”,。
7.在Detectors/Amps對(duì)話框中,,調(diào)整FSC和SSC探測(cè)器中的信號(hào)倍增度:PMT voltages(粗調(diào))與Amp Gains(細(xì)調(diào)),使樣品信號(hào)出現(xiàn)在FSC-SSC點(diǎn)圖內(nèi),且三群細(xì)胞合理分布。
8.在Threshold
對(duì)話框中選擇適當(dāng)?shù)膮?shù)設(shè)定Threshold,,并調(diào)整Threshold的高低,,以減少噪音信號(hào)(細(xì)胞碎片)。一般做細(xì)胞表型時(shí)用FSC-H而做DNA時(shí)用FL2-H,。Threshold并不影響檢測(cè)器對(duì)信號(hào)的獲取,,但可改善畫面質(zhì)量。
9.從屏幕左列繪圖工具中選取Region(區(qū)域),,并在靶細(xì)胞周圍設(shè)定區(qū)域線,,即通常所說(shuō)的門。圈定合適的細(xì)胞群可使儀器調(diào)整更為容易,。
10.Detectors/Amps對(duì)話框中,,調(diào)整熒光檢測(cè)器(FL1, FL2, FL3, FL4等)的倍增程度。根據(jù)所用的熒光陰性對(duì)照樣品調(diào)整細(xì)胞群,,使之分布在正確的區(qū)域內(nèi),。
11.在Compensation對(duì)話框中,根據(jù)所用的調(diào)補(bǔ)償用標(biāo)準(zhǔn)熒光樣品調(diào)整雙色(或多色)熒光染色所需的熒光補(bǔ)償,。比如應(yīng)該為FL1+ FL2-
的細(xì)胞群卻分布在FL1+ FL2+區(qū)域內(nèi),,則需調(diào)大FL2-?%FL1中的“,?”,,并從FL1-FL2點(diǎn)圖中觀察新的調(diào)整是否恰當(dāng)
12.在Status對(duì)話框中可見(jiàn):Laser Power:正常值—Run/Ready為14.7mW,,Standby為5mW;Laser current:正常值為6Amps左右,。
13.調(diào)整好的儀器設(shè)定可在Instrument Settings對(duì)話框中儲(chǔ)存,下次進(jìn)行相同實(shí)驗(yàn)時(shí)可調(diào)出使用,,屆時(shí)只需微調(diào)即可,。
本計(jì)算機(jī)中已有三個(gè)名叫儲(chǔ)存于FACStation G3 \BD Applications \CELLQuest Folder\IMM-InstrSettings及FACStation G3 \BD Files \Instrument Settings Files\CalibFile和Mast-Cell-Set的參數(shù)文件,前二者可用于分析人白細(xì)胞,,后者用于分析小鼠肥大細(xì)胞,。
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