PCR注意事項(xiàng)

PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)時(shí)間

　　一般為48h以內(nèi),，有些于當(dāng)日電泳檢測(cè),，大于48h后帶型不規(guī)則甚致消失。

假陰性,，不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶

　　PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備,，②引物的質(zhì)量與特異性，③酶的質(zhì)量及,， ④PCR循環(huán)條件,。尋找原因亦應(yīng)針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。

　　模板：①模板中含有雜蛋白質(zhì),，②模板中含有Taq酶抑制劑,，③模板中蛋白質(zhì)沒(méi)有消 化除凈，特別是染色體中的組蛋白,，④在提取制備模板時(shí)丟失過(guò)多,，或吸入酚。⑤模 板核酸變性不*,。在酶和引物質(zhì)量好時(shí),，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處 理,，模板核酸提取過(guò)程出了毛病,，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng) 固定不宜隨意更改,。

　　酶失活：需更換新酶,，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導(dǎo)致假陰性,。需注意的是有時(shí)忘加Taq酶或溴乙錠,。

　　引物：引物質(zhì)量、引物的濃度,、兩條引物的濃度是否對(duì)稱,，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不 理想、容易彌散的常見(jiàn)原因,。有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問(wèn)題,，兩條引物一條濃度 高，一條濃度低,，造成低效率的不對(duì)稱擴(kuò)增,，對(duì)策為：①選定一個(gè)好的引物合成單 位。②引物的濃度不僅要看OD值,，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳,，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶,，一條引物無(wú)條帶,，此時(shí)做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決,。如一條引物亮度高,，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度,。③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存,，防止多次凍融或長(zhǎng)期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效,。④引物設(shè)計(jì)不合理,，如引物長(zhǎng)度不夠，引物之間形成二聚體等,。

　　Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對(duì)PCR擴(kuò)增效率影響很大,，濃度過(guò)高可降低PCR擴(kuò)增的特 異性，濃度過(guò)低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶,。

　　反應(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20ul、30ul,、50ul,。或100ul,，應(yīng)用多 大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增,，是根據(jù)科研和臨床檢測(cè)不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul 后,，再做大體積時(shí),，一定要模索條件，否則容易失敗,。

　　物理原因：變性對(duì)PCR擴(kuò)增來(lái)說(shuō)相當(dāng)重要,，如變性溫度低，變性時(shí)間短,，極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過(guò)低,，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過(guò)高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì),，檢測(cè)一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性,、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一,。

　　靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失,，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其PCR擴(kuò)增是不會(huì)成功的,。

假陽(yáng)性

　　出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致,，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高,。

　　引物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性,，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列,。靶序列太短或引物太短,，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。需重新設(shè)計(jì)引物,。

　　靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染,，導(dǎo)致假陽(yáng)性。這種假陽(yáng)性可用以下方法解決：操作時(shí)應(yīng)小心輕柔,，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外,。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒,。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用,。必要時(shí)，在加標(biāo)本前,，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射,，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染,，這些小片段比靶序列短,，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇?，與引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物,，而導(dǎo)致假陽(yáng)性的產(chǎn)生,，可用巢式PCR方法來(lái)減輕或消除。

出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶

　　PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致,，或大或小,，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶 與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn),，其原因：一是引物與靶序列不*互補(bǔ),、 或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過(guò)高,、退火溫度過(guò)低,，及PCR循環(huán)次數(shù) 過(guò)多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來(lái)源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來(lái)源的酶 則不出現(xiàn),，酶量過(guò)多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增,。其對(duì)策有：必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引 物。減低酶量或調(diào)換另一來(lái)源的酶,。降低引物量,，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次 數(shù),。適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法(93℃變性,，65℃左右退火與延伸)。

出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶

　　PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶,。其原因往往由于酶量過(guò)多或酶的質(zhì)量 差,，dNTP濃度過(guò)高，Mg2+濃度過(guò)高,，退火溫度過(guò)低,，循環(huán)次數(shù)過(guò)多引起。其對(duì)策有：減少酶量,，或調(diào)換另一來(lái)源的酶,。②減少dNTP的濃度。適當(dāng)降低Mg2+濃 度,。增加模板量,，減少循環(huán)次數(shù)。

克隆PCR產(chǎn)物1)克隆PCR產(chǎn)物的優(yōu)條件是什么,？

插入片段：載體比需實(shí)驗(yàn)確定。1：1（插入片段：載體）常為佳比,，摩爾數(shù)比1：8或8：1也行,。應(yīng)測(cè)定比值范圍。連接用5ul 2X連接液, 50ng質(zhì)粒DNA,1Weiss單位的T4連接酶,，插入片段共10ul,。室溫保溫1小時(shí)，或4℃過(guò)夜,。在這2種溫度下,，缺T-凸出端的載體會(huì)自連，產(chǎn)生藍(lán)斑,。室溫保溫1小時(shí)能滿足大多數(shù)克隆要求,，為提高連接效率，需4℃過(guò)夜,。

2)PCR產(chǎn)物是否需要用凝膠純化,？

如凝膠分析擴(kuò)增產(chǎn)物只有一條帶，不需要用凝膠純化。如可見(jiàn)其他雜帶,，可能是積累了大量引物的二聚體,。少量的引物二聚體的摩爾數(shù)也很高，這會(huì)產(chǎn)生高比例的帶有引物二聚體的克隆,，而非目的插入片段,。為此需在克隆前做凝膠純化。

3)如果沒(méi)有回收到目的片段,，還需要作什么對(duì)照實(shí)驗(yàn),？

A）涂布未轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞。

如有菌落,，表明氨芐失效,，或污染上帶有氨芐抗型的質(zhì)粒，或產(chǎn)生氨芐抗型的菌落,。

B）轉(zhuǎn)化完整質(zhì)粒,，計(jì)算菌落生長(zhǎng)數(shù)，測(cè)定轉(zhuǎn)化效率,。

例如,，將1ug/ul質(zhì)粒1:100稀釋,1ul用于100ul感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。用SOC稀釋到1000ul后,，用100ul鋪板,。培養(yǎng)過(guò)夜，產(chǎn)生1000個(gè)菌落,。轉(zhuǎn)化率為： 產(chǎn)生菌落的總數(shù)/鋪板DNA的總量,。

鋪板DNA的總量是轉(zhuǎn)化反應(yīng)所用的量除以稀釋倍數(shù)。具體而言轉(zhuǎn)化用10ng DNA,，用SOC稀釋到1000u后含10 ng DNA,，用1/10鋪板，共用1 ng DNA,。轉(zhuǎn)化率為：

1000克隆X10（3次方） ng /鋪板1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ ug

轉(zhuǎn)化pGEM-T應(yīng)用10（8次方）cfu/ ug感受態(tài)細(xì)胞

如沒(méi)有菌落或少有菌落,，感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率太低。

C）如用pGEM-T正對(duì)照,，或PCR產(chǎn)物,，產(chǎn)生>20-40藍(lán)斑（用步驟10（8次方）cfu/ ug感受態(tài)細(xì)胞），表明載體失去T,?？赡苁沁B接酶污染了核酸酶。T4 DNA連接酶（M1801,，M1804,，M1794）質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)好無(wú)核酸酶污染,，不應(yīng)用其它來(lái)源的T4 DNA連接酶替換。

D）用pGEM-T或pGEM-T Easy載體,，連接pGEM-T正對(duì)照,，轉(zhuǎn)化高頻率感受態(tài)細(xì)胞（10（8次方）cfu/ug）,按照的實(shí)驗(yàn)步驟，可得100個(gè)菌落,，其中60%應(yīng)為白斑,，如產(chǎn)生>20-40藍(lán)斑, 沒(méi)有菌落或少有菌落，連接有問(wèn)題,。

4)對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果好,，卻沒(méi)有回收到目的片段，實(shí)驗(yàn)出了什么問(wèn)題,？

A）連接用室溫保溫1小時(shí),，能滿足大多數(shù)克隆，為提率,，需4℃過(guò)夜,。

B）插入片段帶有污染，使3`-T缺失,，或抑制連接,，抑制轉(zhuǎn)化。為此,，將插入片段和pGEM-T正對(duì)照混合,，再連接。如降低了對(duì)照的菌落數(shù),，插入片段需純化,，或重新制備。如產(chǎn)生大量的藍(lán)斑,，插入片段污染有核酸酶,，使pGEM-T或pGEM-T Easy載體3`-T缺失。