理論基礎(chǔ)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)作為一種革命性的方法在生物學(xué)研究的歷史中占據(jù)了重要的地位,。以此為基礎(chǔ)發(fā)展出包括real-time PCR在內(nèi)的多項應(yīng)用技術(shù),。自誕生后real-time PCR技術(shù)持續(xù)發(fā)展,，從簡單的增擴(kuò)到整個PCR過程,，real-time PCR表現(xiàn)出比PCR更敏感,、更明確的定量分析特性和對識別等位基因的能力。

不少人以為real-time就是意味著可以在顯示器上看到每個循環(huán)增擴(kuò)曲線的增長,。事實并非如此,，早期的軟件不能在運(yùn)行期間提供可視化的增擴(kuò)曲線。主要是因為SDS軟件采用整個平臺終的數(shù)據(jù)執(zhí)行數(shù)據(jù)分析工作,，而不是分析每個單獨的反應(yīng)循環(huán),。對某些設(shè)備來說,，必須向分析軟件提供實時的終的數(shù)據(jù)，有些設(shè)備則不需要,。前一種設(shè)備允許軟件實時跟蹤每個加樣口的增擴(kuò)曲線,，同時顯示在電腦屏幕上。Real-time PCR其實是一種real-time設(shè)備,。

RNA定量分析依靠逆轉(zhuǎn)錄酶制作cDNA（complementary DNA）,。常見的逆轉(zhuǎn)錄酶有2種，AMV和MMLV,。AMV是一種鳥類myeloblastosis病毒的二聚體蛋白質(zhì)，MMLV來自于鼠科leukemia病毒的monomeric蛋白,。2種酶都有RNase把RNA變性為RNA-DNA雜交體的活性,，比較而言AMV有更高的RNase H活性。RNase H活性和依賴于RNA的DNA聚合酶活性能被mutagenesis區(qū)分開來,。更重要的是每個AMV能把較多的分子聚攏在一起,，推動增擴(kuò)反應(yīng)的進(jìn)行。原生的AMV有高于MMLV的適用溫度,，42?C對37?C,。修改后的變種可以有更高的溫度極限，分別是AMV58?C,，MMLV55?C,。

按照以上的描述，大家可能認(rèn)為改造后的AMV是適宜從RNA制作cDNA的酶,。然而,，在實際使用中經(jīng)改造的MMLV工作的較好。其中的原因目前仍不明,，猜測高溫破壞了2種酶的聚合酶活性,，但殘留的DNA綁定活性對Taq polymerase形成物理障礙。二聚體構(gòu)象和較高的溫度極限也許使得AMV表現(xiàn)不佳,。出于這個原因應(yīng)在實驗中盡可能少的使用逆轉(zhuǎn)錄酶,。需要強(qiáng)調(diào)的是即使沒有引物cDNA仍然能被逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)制造出來，RNA模板的二級結(jié)構(gòu)可能自我引發(fā)反應(yīng),。有3種方法可以準(zhǔn)備逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：oligo-dT,，random primers or assay-specific primers。其中oligo-dT的使用較廣泛,，它使用mRNAs作為模板,。但是不是所有mRNA都有poly-A尾，大的問題是oligo-dT把增擴(kuò)區(qū)域限制在了mRNA poly-A 尾的附近,。當(dāng)轉(zhuǎn)錄較長的片段時（<500bp）反應(yīng)開始于3’ UTR,。這樣的結(jié)果有高的忠實性,，也意味著增擴(kuò)出的序列可能不會跨過一個外顯子連接。對于有些實驗,，3’ UTR富含不利于PCR實驗的A/T堿基,。因此使用自由引物制造轉(zhuǎn)錄序列放棄3’ UTR，但自由引物也同時會制造核糖體和transfer RNAs的cDNA,，出現(xiàn)大量且復(fù)雜的cDNA,。第三種方法是使用針對每個實驗的引物（assay-specific primers），理論上講這種引物滿足轉(zhuǎn)錄目標(biāo)序列的要求,，得到相應(yīng)的cDNA產(chǎn)物,。

Real-time PCR反應(yīng)增擴(kuò)子的大長度大約在250 bases，從前面的討論可知assay-specific primers是大多數(shù)實驗較佳的選擇,。但是assay-specific primers有2個明顯的缺點,，每次PCR反應(yīng)使用較多的RNA樣本，不能用于一臺儀器上同時處理幾種樣本的反應(yīng),。注意根據(jù)實驗需要合理的選擇引物,，安排實驗計劃。

現(xiàn)代PCR反應(yīng)的核心是耐熱DNA聚合酶,，常用的是Thermus aquaticus也稱Taq,。野生型Taq是依賴DNA從5->3合成的，具有3->5校對功能的聚合酶,，它也有5’-nuclease的活性,。Real-time PCR常用變異后移除校對功能的品種。市場上有2種版本的Taq,，修改后的Taq和熱啟動（hot start）Taq,。

現(xiàn)今市場上的real-time PCR設(shè)備均使用熒光劑作為信號源，熒光的強(qiáng)度隨著增擴(kuò)產(chǎn)物的增加而成比例的增長,。熒光劑分子吸收光線中狹小波長的光子,，能被染料吸收的光線叫做激發(fā)波長。激發(fā)后的分子處于較高的能量狀態(tài),，持續(xù)時間很短,，分子迅速衰退到原先的狀態(tài)。在這個過程中一個光子以較長的波長發(fā)散出來,，對于每一個熒光染料都有一個優(yōu)化的激發(fā)和發(fā)散波長,。在狹窄的優(yōu)化波長范圍內(nèi)，熒光分子能被激發(fā)或檢測到,。熒光實驗主要要求在初和后的10個PCR循環(huán)中信號強(qiáng)度有盡可能大的差異,。個熒光劑染料分子（donor或reporter）由外部的優(yōu)化波長光線激活后，釋放出較長波的光線去激活臨近的另一個分子（acceptor）,，這樣的過程稱為三角洲,。接受光線的分子可能會也可能不會釋放出光線,。每一次的轉(zhuǎn)發(fā)過程都會使波長有所增加，直至real-time設(shè)備能接收到,。Real-time PCR的熒光劑按照功能區(qū)分有3個類型,，1. Donor發(fā)散出的熒光信號在實驗過程中被檢測到。2. Acceptor負(fù)責(zé)冷卻Donor發(fā)出的信號,。3. 是參照染料,，參照染料不與其他成分產(chǎn)生反應(yīng)，軟件用它校正不同加樣孔的信號,。理論上講,，熒光劑染料可以成為reporter。常見的染料有6-FAM (6-carboxy fluorescein)和YBR® Green I,，前一種能被由氬離子激光制造的488 nm的波長激發(fā),。6-FAM容易和寡核苷酸結(jié)合釋放出一個強(qiáng)信號。YBR® Green I與6-FAM不同,，是一種自由染料。

冷卻分子可以是熒光染料也可以是其他能吸收恰當(dāng)波長的光線能量的分子,，原來和6-FAM一起使用的是TAMRA (6-carboxy-tetramethylrhodamine),。FAM在靠近TAMAR的位置上有效地吸收光子能量。除此之外,，不發(fā)光的黑色染料也可用于reporter,。常見的有DABSYL (4-(dimethylamino)azobenzene-4’-sulfonyl chloride)。參照組的熒光信號比較每個加樣孔的不同,，保證每個加樣孔的信號在整體上較平穩(wěn),。設(shè)備上的不同會形成加樣孔之間數(shù)值的偏差，叫做“邊緣效應(yīng)”,，要求對每個加樣孔的數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)化,。但是當(dāng)邊緣效應(yīng)過大，內(nèi)側(cè)加樣孔和外側(cè)加樣孔的差距過大就不再適合參照組作為標(biāo)準(zhǔn)化的依據(jù),。常見的參照染料是ROX (6-carboxy-X-rhodamine)

Real-time PCR設(shè)備組成

介紹市場上全部real-time PCR的使用不是明智的事,，但是知道基本常識，了解設(shè)備如何工作,，設(shè)備結(jié)構(gòu)和物理限制還是有必要的,。Real-time PCR有3大部分，光源：這決定了熒光染料的范圍,，探測系統(tǒng)：決定了光譜范圍和敏感度,。熱循環(huán)機(jī)制：決定了每次實驗的速度，樣本間統(tǒng)一的溫度變化,，樣本數(shù)量,。

Real-time PCR的光源有4種,，氬離子激光，LED激光,，石英鹵素鎢燈和氙燈,。每一種不同的光源決定了設(shè)備的工作能力，氬離子激光主要的工作光譜在488 nm,，對reporter來講是個的波長,。但在紅光下488 nm給出一個較弱的染料激發(fā)，*過大的500 nm時伴隨弱化的信號,。較弱的信號限制reporter 染料的效用,。LED激光發(fā)出30-40 nm的光線，輸出的能量比氬離子激光微弱,，但能源使用費(fèi)用較低,。常用光源是石英鹵素鎢燈，這種燈泡能發(fā)射出穩(wěn)定的360 nm至1000nm波長的光線,，覆蓋全部可見光,，有時也叫“白光”。與以上提到的激光不同,，需使用2組激發(fā)和散射濾鏡來選擇使用的波長,，有些設(shè)備使用光電倍增管和CCD攝像機(jī)捕獲信號。氙燈的亮度遠(yuǎn)高于石英鹵素鎢燈,，波長與其相似,。使用5組激發(fā)濾鏡和2組散發(fā)濾鏡。

發(fā)展趨勢

Real-time PCR呈現(xiàn)出3個發(fā)展方向

1.   初的real-time PCR只能處理單一的樣本,，現(xiàn)在越來越多的設(shè)備具有更廣闊的運(yùn)行能力,，許多設(shè)備可以提供5至6個新穎的激發(fā)/發(fā)散濾鏡。理論上講,，每個反應(yīng)可以允許5至6個不同的樣本同時實驗,。每個reporter釋放出的光線按物理手段分開，

2.   Real-time PCR設(shè)備執(zhí)行熱循環(huán)的能力加強(qiáng)了,， 可裝入的樣本數(shù)量增加,，化學(xué)試劑的改進(jìn)縮短了了每次運(yùn)行的時間，縮短時間對于高通量用戶是重要的性能指標(biāo),。

3.   提高樣本產(chǎn)量,。目前產(chǎn)量高的real-time PCR是ABI 7900能夠一次裝入384個樣本，這種容量已經(jīng)*出一般實驗室的需求,。但對某些用戶來來講,，更高產(chǎn)的設(shè)備1536個樣本處理能力成為標(biāo)準(zhǔn)配置。