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大鼠基質(zhì)金屬蛋白酶10(MMP-10)ELISA試劑盒使用方法

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大鼠基質(zhì)金屬蛋白酶10(MMP-10)ELISA試劑盒說明書


樣本處理及要求:


1. 血清:室溫血液自然凝固10-20分鐘,離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分),。仔細(xì)收集上清,,保存過程中如出現(xiàn)沉淀,應(yīng)再次離心,。

2. 血漿:應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑,,混合10-20分鐘后,離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分),。仔細(xì)收集上清,,保存過程中如有沉淀形成,應(yīng)該再次離心,。


3. 尿液:用無菌管收集,,離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清,,保存過程中如有沉淀形成,,應(yīng)再次離心,。胸腹水、腦脊液參照實行,。


4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清:檢測分泌性的成份時,,用無菌管收集。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分),。仔細(xì)收集上清,。檢測細(xì)胞內(nèi)的成份時,用PBS(PH7.2-7.4)稀釋細(xì)胞懸液,,細(xì)胞濃度達(dá)到


100萬/ml左右,。通過反復(fù)凍融,以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份,。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分),。仔細(xì)收集上清。保存過程中如有沉淀形成,,應(yīng)再次離心,。


5. 組織標(biāo)本:切割標(biāo)本后,稱取重量,。加入一定量的PBS,,PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。?biāo)本融化后仍然保持2-8℃的溫度,。加入一定量的PBS(PH7.4),,用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分,。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清,。分裝后一份待檢測,,其余冷凍備用。

6. 標(biāo)本采集后盡早進行提取,,提取按相關(guān)文獻進行,,提取后應(yīng)盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗,,可將標(biāo)本放于-20℃保存,,但應(yīng)避免反復(fù)凍融.


7. 不能檢測含NaN3的樣品,因NaN3抑制辣根過氧化物酶的(HRP)活性,。


操作步驟


1. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣:在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔10孔,,在di一、第二孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品100μl,,然后在di一,、第二孔中加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl,,混勻;然后從di一孔,、第二孔中各取100μl分別加到第三孔和第四孔,,再在第三、第四孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl,,混勻,;然后在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉,再各取50μl分別取50μl分別加到第七,、第八孔中,,再在第七、第八孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl,,混勻后從第七,、第八孔中加到第五、第六孔中,,再在第五,、第六孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50ul,混勻,;混勻后從第五,、第六孔中各分別取50μl加到第九、第十孔中,,再在第九第十孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl,,混勻后從第九第十孔中各取50μl棄掉。(稀釋后各孔加樣量都為50μl,,濃度分別為180 ng/L,,120 ng/L ,60 ng/L,,30 ng/,,15 ng/L)。

2. 加樣:分別設(shè)空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑,,其余各步操作相同),、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,,然后再加待測樣品10μl(樣品最終稀釋度為5倍),。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,盡量不觸及孔壁,,輕輕晃動混勻,。

3. 溫育:用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。

4. 配液:將30(48T的20倍)倍濃縮洗滌液用蒸餾水30(48T的20倍)倍稀釋后備用,。

5. 洗滌:小心揭掉封板膜,,棄去液體,,甩干,每孔加滿洗滌液,,靜置30秒后棄去,,如此重復(fù)5次,拍干,。

6. 加酶:每孔加入酶標(biāo)試劑50μl,,空白孔除外。

7. 溫育:操作同3,。

8. 洗滌:操作同5,。

9. 顯色:每孔先加入顯色劑A50μl,再加入顯色劑B50μl,,輕輕震蕩混勻,,37℃避光顯色15分鐘.

10. 終止:每孔加終止液50μl,終止反應(yīng)(此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色),。

11. 測定:以空白空調(diào)零,,450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。 測定應(yīng)在加終止液后15分鐘,。

注意事項


1. 試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30 分鐘后方可使用,,酶標(biāo)包被板開封后如未用完,板條應(yīng)裝入密封袋中保存,。


2. 濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出,,稀釋時可在水浴中加溫助溶,洗滌時不影響結(jié)果,。


3. 各步加樣均應(yīng)使用加樣器,,并經(jīng)常校對其準(zhǔn)確性,以避免試驗誤差,。一次加樣時間好控制在5 分鐘內(nèi),,如標(biāo)本數(shù)量多,推薦使用排槍加樣,。


4. 封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染,。


5. 底物請避光保存,。


6. 嚴(yán)格按照說明書的操作進行,試驗結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).


7. 所有樣品,,洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理,。


8. 本試劑不同批號組分不得混用。


9.如需代測或者樣本暫時不測定,,可立即低溫凍存,,溫度越低越好,,中間避免反復(fù)凍融,-20℃以下可保存三個月,-70℃以下可保存六個月,。

10.試劑使用須知:

11.(1)請參照相關(guān)法規(guī),、文獻、MSDS等信息,,理解并掌握好試劑的特性,,再進行安全操作。

12.(2)通常購買試劑時一定要想到一次性用完,。若估算不足有剩余的話,,更加注意其他保管和管理。

13.(3)萬一試劑操作者并非專業(yè)技術(shù)人員,。必須在專業(yè)人士的指導(dǎo)監(jiān)督下進行操作,。對于使用后的廢棄物,不要或者舊的試劑,,應(yīng)按照相關(guān)法律法規(guī)正當(dāng)處理,。

14.(4)購買后,請務(wù)必確認(rèn)標(biāo)簽上的注意事項,;做好預(yù)防顛倒,,摔壞的措施和管理體制;在使用前再次確認(rèn)標(biāo)簽上的注意事項,,做好必要的安全對策,;對沒有標(biāo)明其危害特性、有害特性的,,也要慎重地進行操作,;必須帶好防護用具,小心翼翼進行操作,。


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