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綿羊源性成分探針法熒光定量PCR試劑盒操作步驟
點擊次數(shù)：510 發(fā)布時間：2024-12-24
綿羊源性成分探針法熒光定量PCR試劑盒操作步驟：
1.液氮充分研磨樣品,。
2.收集研磨成粉末的50mg樣品,，置于1.5ml離心管中,。
3.加入350μl65℃預(yù)熱的緩沖液IL,，并加入20μl蛋白酶K劇烈地漩渦振蕩,，確保所有的組織團(tuán)都分散均勻,。
4.65℃水浴20-30min。水浴期間顛倒樣品數(shù)次,。
5.加入350μl氯仿,，充分混勻，12,000 rpm(~13,400×g)離心5分鐘,。
6.小心地把上清液吸至另一新的1.5ml離心管中,。注意確保不要打散沉淀團(tuán)或把組織碎片也一起轉(zhuǎn)移。
7.加入4μl RNase A,，渦旋混勻,。室溫放置2min。
8.加入二分之一上清體積的緩沖液IB與等體積的無水乙醇,，充分混勻,。如：向300μl上清中加入150μl緩沖液IB與300μl無水乙醇。
9.把上述混勻的液體轉(zhuǎn)移到吸附柱上,。10,000×g離心1 min以結(jié)合DNA,，棄去濾出液體。純化柱*容量為750μl,如果混合液大于750μl,請分兩次過柱,。
10.將吸附柱重新套回收集管中,，加入500μl緩沖液WB至柱子中，10,000×g離心1min,倒棄流出液,；
11.將吸附柱重新套回收集管中,，加入600μl DNA Wash Buffer至柱子中，10,000×g離心1min,倒棄流出液,；
注意：DNA Wash Buffer使用前須按要求用無水乙醇稀釋,。如果放入冰箱中，使用前須恢復(fù)到室溫,。
12.再加入600μl DNA Wash Buffer至柱子中,，8,000×g離心1min,棄去流出液；
13.將吸附柱重新套回2ml收集管中,，轉(zhuǎn)速（>13000×g）離心空結(jié)合柱1min以干燥柱子的基質(zhì),；這一步對下面的洗脫步驟至關(guān)重要。
14.將柱子置于1.5ml滅菌離心管,，加入50-150μl65℃預(yù)熱的洗脫緩沖液EB至柱子的膜中央,。室溫靜置5min；
15. 室溫下，離心(>13000)1min,，以洗脫DNA,。保留含DNA的流出液。將DNA儲于-20℃,。