PCR產(chǎn)物的電泳檢測時(shí)間一般為48h以內(nèi),，有些于當(dāng)日電泳檢測，大于48h后帶型不規(guī)則甚致消失,。
假陰性,，不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶
PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有:
①模板核酸的制備;
②引物的質(zhì)量與特異性;
③酶的質(zhì)量及活性;
④PCR循環(huán)條件。
尋找原因亦應(yīng)針對上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究,。
模板：
①模板中含有雜蛋白質(zhì),；
②模板中含有Taq酶抑制劑；
③模板中蛋白質(zhì)沒有消化除凈,，特別是染色體中的組蛋白,；
④在提取制備模板時(shí)丟失過多，或吸入酚,；
⑤模板核酸變性不*,。
在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶,，極有可能是標(biāo)本的消化處理,，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液,，其程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改,。
酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用,，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性,。需注意的是有時(shí)忘加Taq酶或溴乙錠。
引物：引物質(zhì)量,、引物的濃度,、兩條引物的濃度是否對稱,，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散的常見原因,。有些批號的引物合成質(zhì)量有問題,，兩條引物一條濃度高，一條濃度低,，造成低效率的不對稱擴(kuò)增,，對策為：①選定一個(gè)好的引物合成單位；②引物的濃度不僅要看OD值,，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳,，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致,，如一條引物有條帶,，一條引物無條帶，此時(shí)做PCR有可能失敗,，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決,。如一條引物亮度高，一條亮度低,，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度;③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存,，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效;④引物設(shè)計(jì)不合理,，如引物長度不夠,，引物之間形成二聚體等。
Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴(kuò)增效率影響很大,，濃度過高可降低PCR擴(kuò)增的特異性,，濃度過低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。
反應(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20ul,、30ul,、50ul?；?00ul,，應(yīng)用多大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定,，在做小體積如20ul后,，再做大體積時(shí)，一定要模索條件,，否則容易失敗,。
物理原因：變性對PCR擴(kuò)增來說相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短,，極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過低,，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì),，檢測一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性,、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一,。
靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失,，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列,，其PCR擴(kuò)增是不會成功的,。
假陽性
出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊,，亮度更高,。
引物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí),，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,，容易出現(xiàn)假陽性,。需重新設(shè)計(jì)引物。
靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：
一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染,，導(dǎo)致假陽性,。這種假陽性可用以下方法解決：①操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外;②除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外,，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒,。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用；③必要時(shí),，在加標(biāo)本前,，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸,。
二是空氣中的小片段核酸污染,，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性,?？苫ハ嗥唇樱c引物互補(bǔ)后,，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物,，而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來減輕或消除,。
出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶
PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致,，或大或小,，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn),，其原因：
一是引物與靶序列不*互補(bǔ),、或引物聚合形成二聚體。
二是Mg2+離子濃度過高,、退火溫度過低,，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。
其次是酶的質(zhì)和量,，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn),，酶量過多有時(shí)也會出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對策有：①必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引物,。②減低酶量或調(diào)換另一來源的酶,。③降低引物量，適當(dāng)增加模板量,，減少循環(huán)次數(shù),。④適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法93℃變性，65℃左右退火與延伸,。
出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶
PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶,。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過高,，Mg2+濃度過高,，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起,。其對策有：①減少酶量,，或調(diào)換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度,。③適當(dāng)降低Mg2+濃度,。④增加模板量，減少循環(huán)次數(shù),。
PCR污染與對策
PCR反應(yīng)的zui大特點(diǎn)是具有較大擴(kuò)增能力與*的靈敏性,，但令人頭痛的問題是易污染，極其微量的污染即可造成假陽性的產(chǎn)生,。
污染原因
一標(biāo)本間交叉污染:標(biāo)本污染主要有收集標(biāo)本的容器被污染,，或標(biāo)本放置時(shí)，由于密封不嚴(yán)溢于容器外,，或容器外粘有標(biāo)本而造成相互間交叉污染;標(biāo)本核酸模板在提取過程中,，由于吸樣槍污染導(dǎo)致標(biāo)本間污染;有些微生物標(biāo)本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴(kuò)散，導(dǎo)致彼此間的污染。
二PCR試劑的污染:主要是由于在PCR試劑配制過程中,，由于加樣槍,、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染.
三PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染:這是PCR反應(yīng)中zui主要zui常見的污染問題,，因?yàn)?a >PCR產(chǎn)物拷貝量大一般為1013拷貝/ml,，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PCR檢測數(shù)個(gè)拷貝的極限，所以極微量的PCR產(chǎn)物 污染,，就可造成假陽就可形成假陽性,。
還有一種容易忽視，zui可能造成PCR產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染;在空氣與液體面摩擦?xí)r就可形成氣溶膠,，在操作時(shí)比較劇烈地?fù)u動反應(yīng)管,，開蓋時(shí)、吸樣時(shí)及污染進(jìn)樣槍的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染.據(jù)計(jì)算一個(gè)氣溶膠顆?？珊?8000拷貝,，因而由 其造成的污染是一個(gè)值得特別重視的問題。
四實(shí)驗(yàn)室中克隆質(zhì)粒的污染:在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室及某些用克隆質(zhì)粒做陽性對照的檢驗(yàn)室,，這個(gè)問題也比較常見,。因?yàn)?a >克隆質(zhì)粒在單位容積內(nèi)含量相當(dāng)高，另外在純化過程中需用較多的用具及試劑,，而且在活細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒,，由于活細(xì)胞的生長繁殖的簡便性及具有很強(qiáng)的生命力，其污染可能性也很大,。
污染的監(jiān)測
一個(gè)好的實(shí)驗(yàn)室，要時(shí)刻注意污染的監(jiān)測,，考慮有無污染是什么原因造成的污染,，以便采取措施，防止和消除污染,。
對照試驗(yàn)
1.陽性對照:在建立PCR反應(yīng)實(shí)驗(yàn)室及一般的檢驗(yàn)單位都應(yīng)設(shè)有PCR陽性對照,，它是PCR反應(yīng)是否成功、產(chǎn)物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個(gè)重要的參考標(biāo)志,。陽性對照要選擇擴(kuò)增度中等,、重復(fù)性好，經(jīng)各種鑒定是該產(chǎn)物的標(biāo)本,，如以重組質(zhì)粒為陽性對照,，其含量宜低不宜高100個(gè)拷貝以下，但陽性對照尤其是重組質(zhì)粒及高濃度陽性標(biāo)本,，其對檢測或擴(kuò)增樣品污染的可能性很大,。因而當(dāng)某一PCR試劑經(jīng)自己使用穩(wěn)定，檢驗(yàn)人員心中有數(shù)時(shí)，在以后的實(shí)驗(yàn)中可免設(shè)陽性對照,。
2.陰性對照:每次PCR實(shí)驗(yàn)務(wù)必做陰性對照,。它包括①標(biāo)本對照:被檢的標(biāo)本是血清就用鑒定后的正常血清作對照;被檢的標(biāo)本是組織細(xì)胞就用相應(yīng)的組織細(xì)胞作對照。②試劑對照:在PCR試劑中不加模板DNA或RNA,，進(jìn)行PCR擴(kuò)增,，以監(jiān)測試劑是否污染。
3.重復(fù)性試驗(yàn)
4.選擇不同區(qū)域的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增
防止污染的方法
1.合理分隔實(shí)驗(yàn)室:將樣品的處理,、配制PCR反應(yīng)液,、PCR循環(huán)擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物的鑒定等步驟分區(qū)或分室進(jìn)行，特別注意樣本處理及PCR產(chǎn)物的鑒定應(yīng)與其它步驟嚴(yán)格分開,。能劃分①標(biāo)本處理區(qū);②PCR反應(yīng)液制備區(qū);③PCR循環(huán)擴(kuò)增區(qū);④PCR產(chǎn)物鑒定區(qū),。其實(shí)驗(yàn)用品及吸樣槍應(yīng)，實(shí)驗(yàn)前應(yīng)將實(shí)驗(yàn)室用紫外線消毒以破壞殘留的DNA或RNA,。
2.吸樣槍:吸樣槍污染是一個(gè)值得注意的問題,。由于操作時(shí)不慎將樣品或模板核酸吸入槍內(nèi)或粘上槍頭是一個(gè)嚴(yán)重的污染源，因而加樣或吸取模板核酸時(shí)要十分小心,，吸樣要慢,，吸樣時(shí)盡量一次性完成，忌多次抽吸,，以免交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠污染,。
3.預(yù)混和分裝PCR試劑:所有的PCR試劑都應(yīng)小量分裝，如有可能,，PCR反應(yīng)液應(yīng)預(yù)先配制好,，然后小量分裝，-20℃保存,。以減少重復(fù)加樣次數(shù),，避免污染機(jī)會。另外,，PCR試劑,，PCR反應(yīng)液應(yīng)與樣品及PCR產(chǎn)物分開保存，不應(yīng)放于同一冰盒或同一冰箱,。
4.防止操作人員污染,，使用一次性手套、吸頭,、小離心管應(yīng)一次性使用,。
5.設(shè)立適當(dāng)?shù)年栃詫φ蘸完幮詫φ眨栃詫φ找阅艹霈F(xiàn)擴(kuò)增條帶的zui低量的標(biāo)準(zhǔn)病原體核酸為宜,，并注意交叉污染的可能性,，每次反應(yīng)都應(yīng)有一管不加模板的試劑對照及相應(yīng)不含有被擴(kuò)增核酸的樣品作陰性對照,。
6.減少PCR循環(huán)次數(shù)，只要PCR產(chǎn)物達(dá)到檢測水平就適可而止,。
7.選擇質(zhì)量好的Eppendorf管,，以避免樣本外溢及外來核酸的進(jìn)入，打開離心管前應(yīng)先離心,，將管壁及管蓋上的液體甩至管底部,。開管動作要輕，以防管內(nèi)液體濺出,。
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