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布魯氏菌病檢測技術(shù)

1.概況
        布魯氏菌病（簡稱布?。?，是由布魯氏菌引起的一種人畜共患的傳染病。臨床主要特征是母畜流產(chǎn),、乳腺炎,、不育和各種組織（如睪丸、關(guān)節(jié)）的炎癥,。人類感染布病后,，病程長，反復(fù)發(fā)作,，長期不愈,。布病幾乎遍及世界各地。凡有牲畜的地區(qū)都有布病流行,。據(jù)不*統(tǒng)計,，在160個國家和地區(qū)中就有123個國家和地區(qū)有布病發(fā)生,。我國多見于內(nèi)蒙古、東北,，西北等牧區(qū),。在北方農(nóng)區(qū)也有散發(fā)，常呈地地方性流行,。
　　在不良環(huán)境,，如抗生素的影響下，本菌易發(fā)生變異,，通常變異形成的布魯氏菌可在機(jī)體內(nèi)長期存在,。該菌對熱抵抗力不強(qiáng)，63℃經(jīng)7～10 min可被殺死,，在鮮乳中可存活2天到18個月,，在凍肉中可存活14～47天，在干燥土壤和胎兒體內(nèi)可分別存活37天和6個月,。對常用消毒藥敏感,，如0.1％升汞數(shù)分鐘，1％來蘇兒或2％福爾馬林15 min可將其殺死,。日光下曝曬4 h可殺死本菌,。
　　人和多種動物對布魯氏菌易感,。動物中羊,、牛、豬的易感性zui強(qiáng),。母畜比公畜,，成年畜比幼年畜發(fā)病多。在母畜中,，*次妊娠母畜發(fā)病較多,。帶菌動物，尤其是病畜,、流產(chǎn)胎兒,、胎衣是主要傳染源。消化道,、呼吸道,、生殖道是主要的感染途徑，也可通過損傷的皮膚,、粘膜等感染,。常呈地方性流行。人主要通過皮膚,、粘膜和呼吸道感染,。
        本病一年四季均可發(fā)病,。流行區(qū)在發(fā)病高峰季節(jié)（春末夏初）可呈點狀暴發(fā)流行?；疾∨c職業(yè)有密切關(guān)系,，如：獸醫(yī)、畜牧工作者,、屠宰工人,、皮毛工  等感染機(jī)會較高。
       人類布魯氏菌病的預(yù)防,，首先要注意職業(yè)性感染,，凡在動物養(yǎng)殖區(qū)、屠宰區(qū),、畜產(chǎn)品加工廠的工作者以及獸醫(yī),、實驗室工作人員等，必須嚴(yán)守防護(hù)制度（即穿著防護(hù)服裝,，做好消毒工作）,，尤其在仔畜大批生產(chǎn)季節(jié)。更要特別注意,。病畜乳肉食品必須滅菌后食用,。必要時可用疫苗接種，接種前應(yīng)行變態(tài)反應(yīng)試驗,。陰性反應(yīng)者才能接種,。

2.實驗室監(jiān)測技術(shù)概述（據(jù)布魯氏菌病防治技術(shù)規(guī)范）
2.1檢測方法 血清學(xué)實驗或細(xì)菌分離。初篩試驗選用虎紅平板凝集試驗（RBPT）或乳牛布病全乳環(huán)狀試驗（MRT）（見GB/T 18646）,。正式試驗選用動物布病試管凝集試驗（SAT）或動物布病補(bǔ)體結(jié)合試驗（CFT）（見GB/T 18646）
2.2監(jiān)測對象：牛、羊,、豬,、鹿等動物。
2.3監(jiān)測方法：采用流行病學(xué)調(diào)查,、血清學(xué)方法,，結(jié)合細(xì)菌分離進(jìn)行監(jiān)測。
2.4監(jiān)測范圍,、數(shù)量
         免疫地區(qū)：對新生畜,、未免疫畜、免疫一年半或口服免疫一年以后的牲畜進(jìn)行監(jiān)測（豬可在口服免疫半年后進(jìn)行）,。監(jiān)測至少每年進(jìn)行一次,，牧區(qū)縣抽檢500頭（只）以上，農(nóng)區(qū)和半農(nóng)半牧區(qū)抽檢200頭（只）以上,，交通不便的邊遠(yuǎn)地區(qū)抽檢3個鄉(xiāng)9個村50%的牲畜進(jìn)行血清學(xué)監(jiān)測,。
         非免疫地區(qū)：監(jiān)測至少每年進(jìn)行一次,。達(dá)到控制標(biāo)準(zhǔn)的牧區(qū)縣抽檢1000頭（只）以上，農(nóng)區(qū)和半農(nóng)半牧區(qū)抽檢500頭（只）以上,；達(dá)到穩(wěn)定控制標(biāo)準(zhǔn)的牧區(qū)縣抽檢500頭（只）以上,，農(nóng)區(qū)和半農(nóng)半牧區(qū)抽檢200頭（只）以上。
         所有的奶牛,、奶山羊和種畜每年必須進(jìn)行兩次血清學(xué)監(jiān)測,。
2.5監(jiān)測時間
        對成年動物監(jiān)測時，豬,、羊在5月齡以上,，牛在8月齡以上，懷孕動物則在第1胎產(chǎn)后半個月至1個月間進(jìn)行,；對S2、M5,、S19菌苗免疫接種過的動物,，在接種后18個月（豬接種后6個月）進(jìn)行。
2.6監(jiān)測結(jié)果的判定與報告
        初篩試驗出現(xiàn)陽性反應(yīng),，并有流行病學(xué)史和臨床癥狀或分離出布魯氏菌，判為病畜,。
        血清學(xué)正式試驗中試管凝集試驗陽性或補(bǔ)體結(jié)合試驗陽性,，判為陽性畜。
        判定時應(yīng)注意排除其它疑似疾病和菌苗接種引起的血清學(xué)反應(yīng),。
        按要求使用和填寫監(jiān)測結(jié)果報告,，并及時上報。
        疫情處理必須嚴(yán)格執(zhí)行《牛結(jié)核病防治技術(shù)規(guī)范》的有關(guān)要求,。

3.實驗室檢測方法 
        實驗室檢測包括以下幾種方法：
3.1細(xì)菌學(xué)檢測
        將樣品剪成小塊,，用鑷子夾住直接涂抹在肝湯瓊脂平板上,，一式兩份,，一份放10%二氧化碳中培養(yǎng)，一份在普通環(huán)境中培養(yǎng),，一般37℃培養(yǎng)10天,，布氏桿菌菌落在上述瓊脂板上呈無色、透明,、圓形,、隆起,、表面光滑、均質(zhì)樣的菌落,、菌落中央有時有很小的顆粒,，菌落開始微透明，以后逐漸變?yōu)榛鞚?，菌落大小不等,。挑取菌落涂片鏡檢即可發(fā)現(xiàn)布氏桿菌。
        用母畜流產(chǎn)的胎兒組織和胎衣涂片鏡檢也能檢測到布氏桿菌,。
3.2凝集反應(yīng)試驗 
3.2.1方法
       目前對于布病的診斷多采用凝集反應(yīng)試驗,，主要檢測血清或乳中的抗布魯氏菌抗體。常用的監(jiān)測方法有虎紅平板凝集試驗,、布病試管凝集試驗,、全乳環(huán)狀試驗、補(bǔ)體結(jié)合試驗,。虎紅平板凝集試驗和全乳環(huán)狀試驗適用于家畜布病田間篩選試驗和乳牛場布病的監(jiān)測及診斷泌乳母牛布病的初篩試驗,；試管凝集試驗和補(bǔ)體結(jié)合試驗適用于診斷羊種,、牛種和豬種布病感染的家畜。
3.2.2病料
3.2.2.1   虎紅平板凝集試驗,、試管凝集試驗和補(bǔ)體結(jié)合試驗的病料為血清,，即按常規(guī)方法采血分離制備的血清，血清應(yīng)新鮮,，無明顯蛋白凝塊,，無溶血，無腐敗氣味,。
3.2.2.2   乳牛布病全乳環(huán)狀試驗的病料為新鮮,、潔凈的全乳，采樣時應(yīng)將母畜的乳房用溫水洗凈,、擦干,，然后將乳液擠入潔凈的器皿中。
3.2.3操作步驟 （僅介紹常用的虎紅平板凝集試驗和試管凝集試驗）
3.2.3.1虎紅平板凝集試驗主要的操作過程：
3.2.3.1.1  標(biāo)準(zhǔn)陰,、陽性血清對照試驗
        分別吸取陽性血清和陰性血清各0.03ml,，分別滴于玻璃板上，在陽,、陰性血清旁滴各加0.03ml抗原,，用牙簽攪動血清和抗原，使之充分混合,， 2min時判斷結(jié)果,，陽性血清有凝集現(xiàn)象,；陰性血清無凝集現(xiàn)象，呈均勻粉紅色,。
3.2.3.1.2  檢測樣品
        分別吸取待檢血清各0.03ml,，滴于玻璃板上，在待檢血清旁各滴加0.03ml抗原,，用牙簽攪動血清和抗原,，使之充分混合，2min時判斷結(jié)果 ,。
3.2.3.1.3  結(jié)果判定方法和依據(jù):
        在陰,、陽性血清對照成立的條件下，方可對被檢血清進(jìn)行判定,；受檢血清4min內(nèi)出現(xiàn)肉眼可見凝集現(xiàn)象者判為陽性（+）,，無凝集現(xiàn)象，呈均勻粉紅色者判為陰性（-）,。
3.2.3.2試管凝集試驗主要的操作過程：
3.2.3.2.1  受檢血清的稀釋度：一般情況,，牛、馬和駱駝用1：50,，1：100,，1：200和1：400四個稀釋度。大規(guī)模檢疫時也可只用兩個稀釋度即牛,、馬和駱駝為1：50和1：100,；豬、山羊,、綿羊和狗為1：25和1：50,。
3.2.3.2.2  稀釋血清（以羊、豬為例）和加入抗原的方法：
        每份血清用5支小試管（口徑8-10mm）,，*管加入2.3ml石炭酸生理鹽水,，第二管不加，第三,、四和第五管各加入0.5ml,。用1ml吸管吸取受檢血清0.2ml,，加入*管中,，并混合均勻?；旌戏椒ǎ菏菍⒃撛嚬苤械幕旌弦何胛軆?nèi),，再沿管壁吹入原試管中，如此吸入,、吸出三,、四次,。混勻后,，以該吸管吸取混合液分別加入第二管和第三管,，每管0.5ml。以該吸管將第三管的混合液混勻（方法同前）吸取0.5ml加入第四管混合后,，又從第四管吸出0.5ml加入第五管,，第五管混勻完畢棄去0.5ml。如此稀釋之后從第二管起血清稀釋度分別為1：12.5,，1：25,，1：50和1：100。
        血清規(guī)定用0.5%石炭酸生理鹽水稀釋,，但檢驗羊血清時用0.5%石炭酸10%鹽水溶液稀釋,。
        加入抗原的方法：先以0.5%石炭酸生理鹽水，將抗原原液作20倍稀釋（如果血清用0.5%石炭酸,，10%鹽水溶液稀釋則抗原原液亦須用0.5%石炭酸,，10%鹽水溶液稀釋）然后加入上述各管（*管不加，留作血清蛋白凝集對照）,，每管0.5ml,，振搖均勻，加入抗原后,，第二管至第五管各管混合液的溶積均為1ml,，血清稀釋度從第三管起依次變?yōu)?：25，1：50,，1：100和1：200,。
        牛、馬和駱駝血清稀釋和加抗原法,，具體方法與上述的是一致的,，不同的是，*管加2.4ml0.5%石炭酸生理鹽水和0.1ml受檢血清,，加抗原以后從第二管到五管血清稀釋度為1：50,、1：100、1：200和1：400,。
3.2.3.2.3  對照管的制作：
        每次試驗須作三種對照各一份,。
        陰性血清對照：陰性血清的稀釋和加抗原的方法與受檢血清同。
        陽性血清對照：陽性血清對照須稀釋到其原有滴度,，加抗原的方法與受檢血清相同,。
        抗原對照（了解抗原是否有自凝現(xiàn)象）：加1：20抗原稀釋液0.5ml于試管中，再加0.5ml0.5%石炭酸生理鹽水（如果血清用0.5%石炭酸，10%鹽水溶液稀釋則也加入0.5%石炭酸,，10%鹽水溶液）,。
3.2.3.2.4  比濁管的制作：
       每次試驗須配制比濁管作為判定清亮程度（凝集反應(yīng)程度）的依據(jù)，配制方法如下：取本次試驗用的抗原稀釋液（即抗原原液20倍稀釋液）5—10ml加入等量的0.5%石炭酸生理鹽水（如果血清用0.5%石炭酸,，10%鹽水溶液稀釋則加入0.5%石炭酸,，10%鹽
水溶液）作對倍稀釋，然后按下表配制比濁管,。