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免疫濁度測定
閱讀：3607發(fā)布時間：2017-5-8
免疫濁度測定(immunoturbidimetry)是將現(xiàn)代光學測量儀器與自動化分析檢測系統(tǒng)相結合應用于沉淀反應，可對各種液體介質(zhì)中的微量抗原,、抗體和藥物及其他小分子半抗原物質(zhì)進行定量測定,。當可溶性抗原與相應抗體特異結合，在二者比例合適時,，在特殊的緩沖液中它們快速形成一定大小的抗原抗體復合物，使反應液體出現(xiàn)濁度,。1959年Schultze等根據(jù)抗原抗體結合后形成的復合物能引起液體介質(zhì)出現(xiàn)濁度改變的原理,，建立了透射比濁法(turbidimetry)，形成的濁度使光線的透過量減少,，則光線被吸收的量與免疫復合物(immune complex,，IC)形成量呈正相關，從而根據(jù)所測吸光度值即可推算出待測抗原的量,。1967年Ritchie等利用激光照射在液相中的IC微粒上時部分光線發(fā)生散射的原理,，通過測量散射光的強度來求得待測抗原的量，這種比濁測定稱為散射比濁法(nephelometry),。1977年Sternberg進一步發(fā)展建立了速率散射比濁法(ratenephelometry),，成為目前定量測定微量抗原物質(zhì)并廣泛使用的一種高靈敏度、快速的自動化免疫比濁測定法,。免疫濁度測定可分為速率比濁法和終點比濁法兩種,。
(一)免疫比濁測定的影響因素
1.抗原抗體的比例 抗原抗體的比例是濁度形成的關鍵因素，當抗原和抗體的比例適當時,，二者全部結合,，既無過剩的抗原，也無過剩的抗體,，這時免疫復合物(1C)的形成和解離相等,，其反應式為：Ag+Ab—Ag·Ab。
當抗原過量時,，形成的IC分子小,，而且會發(fā)生再解離,，使?jié)岫确炊陆担馍⑸湟鄿p少,，這就是高劑量鉤狀效應(high does hook effect),。當反應液中抗體過量時，IC的形成隨著抗原遞增而增加,，至抗原,、抗體zui適比例處達zui高峰，這就是經(jīng)典的海德堡(Heidelberger)曲線理論,。
因此,，免疫比濁法的基本原理就是在反應體系中保持抗體過量，如形成抗原過量則造成測定的準確性降低,。
2.抗體的質(zhì)量 免疫比濁測定法要求抗體的特異性強,、效價高、親和力強,，并使用R型抗體,。
(1)抗體的特異性：抗血清zui核心的要求是單價特異性，即該抗體只針對某一種抗原,，與其他無關抗原不發(fā)生交叉反應,，特異性抗體和相應抗原結合后形成的濁度代表真實的試驗結果。
(2)抗體的效價：低效價(<1：20)抗體會增加非特異性濁度(偽濁度)的產(chǎn)生,。
(3)抗體的親和力：親和力是指抗體和抗原結合的牢固程度,。親和力強則抗體的活性高，不僅可以加快抗原抗體反應的速度,，而且形成的IC較牢固,，不易發(fā)生解離，這在速率比濁法中尤為重要,。
(4)R型和H型抗體：根據(jù)抗血清來源的動物種類不同,，分為R型(rabbittype)抗體和H型(horsetype)抗體。R型抗體是指以家兔為代表的小型動物被注射抗原免疫后制備的抗血清,。這類抗血清的特點是親和力較強,，抗原抗體結合后不易發(fā)生解離，H型抗體是指以馬為代表的大型動物注射抗原后制備的抗血清,，這類抗血清的親和力弱,，抗原抗體結合后極易解離。
3.抗原抗體反應的溶液 抗原抗體反應液的zui適pH為6.5—8.5,，超過此限度則不易形成IC,，甚至可引起IC解離。在一定范圍內(nèi),，離子強度大,，IC形成快;離子的種類也可影響IC的形成,，由慢到快依次為SCN—、ClO了,、N03,、Br—、Cl—,、S(X—,、H：P04和HPO擴。因此,，一般常使用磷酸鹽緩沖液作為免疫比濁法的反應液,。
4.增濁劑 某些非離子型親水劑對促進IC的形成有顯著的增強作用，如聚乙二醇(polyethyleneglycol,，PEG),、吐溫-20(tween-20)，其作用是消除蛋白質(zhì)(抗原或抗體)分子周圍的電子云和水化層,，促進抗原,、抗體分子靠近，結合形成大分子復
(二)免疫比濁方法分類
1.透射免疫比濁法 通過檢測光被吸收,、衍射,、反射和折射后光線減弱的變化，來定量抗原抗體的復合物,。
2.散射免疫比濁法 通過檢測光折射和衍射而形成的散射光強度來定量抗原抗體的復合物。該法根據(jù)抗原抗體反應的時間和反應結合的動力學,，又可分為終點散射比濁法,、固定時間散射比濁法和速率散射比濁法。
3.免疫膠乳比濁法 是以膠乳作為載體對小分子免疫復合物進行微量測定,，進一步提高了免疫濁度測定的靈敏度,。
(一)免疫比濁測定的影響因素
1.抗原抗體的比例 抗原抗體的比例是濁度形成的關鍵因素，當抗原和抗體的比例適當時,，二者全部結合,，既無過剩的抗原，也無過剩的抗體,，這時免疫復合物(1C)的形成和解離相等,，其反應式為：Ag+Ab—Ag·Ab。
當抗原過量時,，形成的IC分子小,，而且會發(fā)生再解離,，使?jié)岫确炊陆担馍⑸湟鄿p少,，這就是高劑量鉤狀效應(high does hook effect),。當反應液中抗體過量時，IC的形成隨著抗原遞增而增加,，至抗原,、抗體zui適比例處達zui高峰，這就是經(jīng)典的海德堡(Heidelberger)曲線理論,。
因此,，免疫比濁法的基本原理就是在反應體系中保持抗體過量，如形成抗原過量則造成測定的準確性降低,。
2.抗體的質(zhì)量 免疫比濁測定法要求抗體的特異性強,、效價高、親和力強,，并使用R型抗體,。
(1)抗體的特異性：抗血清zui核心的要求是單價特異性，即該抗體只針對某一種抗原,，與其他無關抗原不發(fā)生交叉反應,，特異性抗體和相應抗原結合后形成的濁度代表真實的試驗結果。
(2)抗體的效價：低效價(<1：20)抗體會增加非特異性濁度(偽濁度)的產(chǎn)生,。
(3)抗體的親和力：親和力是指抗體和抗原結合的牢固程度,。親和力強則抗體的活性高，不僅可以加快抗原抗體反應的速度,，而且形成的IC較牢固,，不易發(fā)生解離，這在速率比濁法中尤為重要,。
(4)R型和H型抗體：根據(jù)抗血清來源的動物種類不同,，分為R型(rabbittype)抗體和H型(horsetype)抗體。R型抗體是指以家兔為代表的小型動物被注射抗原免疫后制備的抗血清,。這類抗血清的特點是親和力較強,，抗原抗體結合后不易發(fā)生解離，H型抗體是指以馬為代表的大型動物注射抗原后制備的抗血清,，這類抗血清的親和力弱,，抗原抗體結合后極易解離。
3.抗原抗體反應的溶液 抗原抗體反應液的zui適pH為6.5—8.5,，超過此限度則不易形成IC,，甚至可引起IC解離。在一定范圍內(nèi),，離子強度大,，IC形成快;離子的種類也可影響IC的形成,，由慢到快依次為SCN—、ClO了,、N03,、Br—、Cl—,、S(X—,、H：P04和HPO擴。因此,，一般常使用磷酸鹽緩沖液作為免疫比濁法的反應液,。
4.增濁劑 某些非離子型親水劑對促進IC的形成有顯著的增強作用，如聚乙二醇(polyethyleneglycol,，PEG),、吐溫-20(tween-20)，其作用是消除蛋白質(zhì)(抗原或抗體)分子周圍的電子云和水化層,，促進抗原,、抗體分子靠近，結合形成大分子復
(二)免疫比濁方法分類
1.透射免疫比濁法 通過檢測光被吸收,、衍射,、反射和折射后光線減弱的變化，來定量抗原抗體的復合物,。
2.散射免疫比濁法 通過檢測光折射和衍射而形成的散射光強度來定量抗原抗體的復合物。該法根據(jù)抗原抗體反應的時間和反應結合的動力學,，又可分為終點散射比濁法,、固定時間散射比濁法和速率散射比濁法。
3.免疫膠乳比濁法 是以膠乳作為載體對小分子免疫復合物進行微量測定,，進一步提高了免疫濁度測定的靈敏度,。
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