酶聯(lián)免疫吸附檢測法ELISA試劑盒測定植物激素含量
一,、原理
植物激素（planthormone）免疫定量主要有放射免疫分析（RIA）和酶聯(lián)吸附免疫分析（ELISA）,，由于前者操作上欠安全等原因，目前常采用后一種類型,。在ELISA中,，抗原抗體反應(yīng)的檢測依靠酶標(biāo)記物來實(shí)現(xiàn)，常用的酶有辣根過氧化物酶和堿性磷酸酯酶,。酶可直接標(biāo)記激素分子,，稱為酶標(biāo)植物激素，也可標(biāo)記于第二抗體（識(shí)別抗
激素抗體Fc片段的抗體或金葡萄球菌A蛋白）,，稱為酶標(biāo)二抗,。這兩類標(biāo)記物分別用于固相抗體型和固相抗原型ELISA,。A.固相抗體型ELISA：將抗激素的單克隆抗體（Mab）與已吸附于固相載體上的兔抗鼠Ig抗體（RAMIG）結(jié)合,，然后加入激素標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品，使其與固相化的Mab結(jié)合,，再加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記激素
（酶標(biāo)激素）,。通過測定酶標(biāo)激素的被結(jié)合量，可換算出未知樣品中激素的數(shù)量,。B.固相抗原型ELISA：將“激素-蛋白”復(fù)合物（該蛋白應(yīng)不同于免疫原中的載體蛋白）包被于固相載體,，加入待測激素（樣品或標(biāo)準(zhǔn)品）和抗IAA多克隆抗體（Pab）反應(yīng)，進(jìn)行競爭反應(yīng),。然后讓HRP標(biāo)記羊抗兔Ig
抗體（HRP-GARIG）與結(jié)合在固相上的Pab反應(yīng),，通過測定與固相結(jié)合的酶量，換算出未知樣品中激素的含量,。
二,、材料,、儀器設(shè)備及試劑
（一）材料：高等植物、真菌,、藻類等組織或器官,。
（二）儀器設(shè)備：
1. 酶聯(lián)免疫檢測儀；
2. 高速冷凍離心機(jī),；
3. 恒溫箱,；
4. 連續(xù)進(jìn)樣器；
5. 渦旋儀,；
6. 96孔微孔板,；
7. 離心管；
8. 研缽或勻漿器,；
9. 試管,。
（三）
試劑
1. 洗滌緩沖液：0.01mol/L pH7.4磷酸緩沖液（PBS），含0.05％Tween-0,；
2. RAMIG溶液,，或“激素-蛋白”復(fù)合物；
3. 0.1％封閉蛋白（該蛋白應(yīng)不同于免疫原中的載體蛋白）,；
4. 抗激素Mab,，或Pab；
5. 激素標(biāo)準(zhǔn)品母液,，及參比系列溶液 （按雙倍或四倍系列稀釋）,；
6. HRP標(biāo)記激素，或HRP-GARIG,；
7. 鄰苯二胺（OPD）基質(zhì)液：5mgOPD溶于12.5ml0.01mol/L pH5.0PBS,，用前加入30％H2O12.5μl 
三、實(shí)驗(yàn)步驟
固相抗體型ELISA試劑盒,。
1. 用方陣法滴定選擇各反應(yīng)物zui適工作濃度,；
2. 將100μlRAMIG溶液包被聚苯乙烯反應(yīng)板微孔，4℃濕盒,，12h,；
3. 棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗滌3次,，甩干,；
4. 加入100μl抗激素Mab溶液，37℃70min,；
5. 棄去孔內(nèi)溶液,，用洗滌緩沖液洗滌3次，甩干,；
6. 各孔內(nèi)依次加入50μl待測樣液,，每個(gè)樣品3次重復(fù),，15～20℃，20min,；
7. 加入50μlHRP標(biāo)記激素,，37℃，60min,；
8. 棄去孔內(nèi)溶液,，用洗滌緩沖液洗滌3次，甩干,；