酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)的操作要點(diǎn)
1 標(biāo)本的采取和保存
可用作ELISA測(cè)定的標(biāo)本十分廣泛,，體液（如血清）,、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液,、糞便）等均可作標(biāo)本以測(cè)定其中某種抗體或抗原成份。有些標(biāo)本可直接進(jìn)行測(cè)定（如血清,、尿液）,，有些則需經(jīng)預(yù)處理（如糞便和某些分泌物）,。大部分ELISA檢測(cè)均以血清為標(biāo)本,。血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外，其他成份均同等于血清,。制備血漿標(biāo)本需借助于抗凝劑,，而血清標(biāo)本只要待血清自然凝固、血塊收縮后即可取得,。除特殊情況外,，在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中均以血清作為檢測(cè)標(biāo)本。在ELISA中血漿和血清可同等應(yīng)用,。血清標(biāo)本可按常規(guī)方法采集,，應(yīng)注意避免溶血，紅細(xì)胞溶解時(shí)會(huì)釋放出具有過(guò)氧化物酶活性的物質(zhì),，以HRP為標(biāo)記的ELISA測(cè)定中,，溶血標(biāo)本可能會(huì)增加非特異性顯色。
血清標(biāo)本宜在新鮮時(shí)檢測(cè),。如有細(xì)菌污染,，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP,，也會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性反應(yīng),。如在冰箱中保存過(guò)久，其中的可發(fā)生聚合,，在間接法ELISA中可使本底加深,。一般說(shuō)來(lái)，在5天內(nèi)測(cè)定的血清標(biāo)本可放置于4℃,，超過(guò)一周測(cè)定的需低溫冰存,。凍結(jié)血清融解后，蛋白質(zhì)局部濃縮,，分布不均,，應(yīng)充分混勻宜輕緩，避免氣泡,，可上下顛倒混和,，不要在混勻器上強(qiáng)烈振蕩?；鞚峄蛴谐恋淼难鍢?biāo)本應(yīng)先離心或過(guò)濾,，澄清后再檢測(cè)。反復(fù)凍融會(huì)使抗體效價(jià)跌落,，所以測(cè)抗體的血清標(biāo)本如需保存作多次檢測(cè),，宜少量分裝冰存。保存血清自采集時(shí)就應(yīng)注意無(wú)菌操作，也可加入適當(dāng)防腐劑,。
2 試劑的準(zhǔn)備
按試劑盒說(shuō)明書(shū)的要求準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)中需用的試劑,。ELISA中用的蒸餾水或去離子水，包括用于洗滌的,，應(yīng)為新鮮的和高質(zhì)量的,。自配的緩沖液應(yīng)用pH計(jì)測(cè)量較正。從冰箱中取出的試驗(yàn)用試劑應(yīng)待溫度與室溫平衡后使用,。試劑盒中本次試驗(yàn)不需用的部分應(yīng)及時(shí)放回冰箱保存,。
3 加樣
在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標(biāo)本,，加酶結(jié)合物,，加底物。加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在LEISA板孔的底部,，避免加在孔壁上部,，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡,。
加標(biāo)本一般用微量加樣器,，按規(guī)定的量加入板孔中。每次加標(biāo)本應(yīng)更換吸嘴,，以免發(fā)生交叉污染,，也可用一次性的定量塑料管加樣。有此測(cè)定（如間接法ELISA）需用稀釋的血清,，可在試管中按規(guī)定的稀釋度稀釋后再加樣,。也可在板孔中加入稀釋液，再在其中加入血清標(biāo)本,，然后在微型震蕩器上震蕩1分鐘以保證混和,。加酶結(jié)合物應(yīng)用液和底物應(yīng)用液時(shí)可用定量多道加液器，使加液過(guò)程迅速完成,。
4 保溫
在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應(yīng),，即加標(biāo)本和加酶結(jié)合物后?？乖贵w反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時(shí)間,，這一保溫過(guò)程稱(chēng)為溫育（incubation），有人稱(chēng)之為孵育,，在ELISA中似不恰當(dāng),。
ELISA屬固相免疫測(cè)定，抗原,、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生,。以抗體包被的夾心法為例,，加入板孔中的標(biāo)本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結(jié)合的機(jī)會(huì),，只有zui貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸,。這是一個(gè)逐步平衡的過(guò)程，因此需經(jīng)擴(kuò)散才能達(dá)到反應(yīng)的終點(diǎn),。在其后加入的酶標(biāo)記抗體與固相抗原的結(jié)合也同樣如此,。這就是為什么ELISA反應(yīng)總是需要一定時(shí)間的溫育。
溫育常采用的溫度有43℃,、37℃,、室溫和4℃（冰箱溫度）等。37℃是實(shí)驗(yàn)室中常用的保溫溫度,，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度,。在建立ELISA方法作反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究時(shí)，實(shí)驗(yàn)表明,，兩次抗原抗體反應(yīng)一般在37℃經(jīng)1-2小時(shí),，產(chǎn)物的生成可達(dá)。為加速反應(yīng),，可提高反應(yīng)的溫度,，有些試驗(yàn)在43℃進(jìn)行，但不宜采用更高的溫度,?？乖贵w反應(yīng)4℃更為*，在放射免疫測(cè)定中多使反應(yīng)在冰箱中過(guò)夜,，以形成zui多的沉淀,。但因所需時(shí)間太長(zhǎng),，在ELISA中一般不予采用,。
保溫的方式除有的ELISA儀器附有特制的電熱塊外，一般均采用水浴,，可將ELISA板置于水浴箱中,，ELISA板底應(yīng)貼著水面，使溫度迅速平衡,。為避免蒸發(fā),，板上應(yīng)加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔,，此時(shí)可讓反應(yīng)板漂浮在水面上,。若用保溫箱，ELISA板應(yīng)放在濕盒內(nèi),，濕盒要選用傳熱性良好的材料如金屬等,，在盒底墊濕的紗布,，zui后將ELISA板放在濕紗布上。濕盒應(yīng)先放在保溫箱中預(yù)溫至規(guī)定的溫度,，特別是在氣溫較低的時(shí)候更應(yīng)如此,。無(wú)論是水浴還是濕盒溫育，反應(yīng)板均不宜疊放,，以保證各板的溫度都能迅速平衡,。室溫溫育的反應(yīng)，操作時(shí)的室溫應(yīng)嚴(yán)格限制在規(guī)定的范圍內(nèi),，標(biāo)準(zhǔn)室溫溫度是指20-25℃,，但具體操作時(shí)可根據(jù)說(shuō)明書(shū)的要求控制溫育。室溫溫育時(shí),，ELISA板只要平置于操作臺(tái)上即可,。應(yīng)注意溫育的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。為保證這一點(diǎn),，一個(gè)人操作時(shí),，一次不宜多于兩塊板同時(shí)測(cè)定。
5 洗滌
洗滌在ELISA過(guò)程中雖不是一個(gè)反應(yīng)步驟,，但卻也決定著實(shí)驗(yàn)的成敗,。ELSIA?是靠洗滌來(lái)達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。通過(guò)洗滌以清除殘留在板孔中沒(méi)能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì),，以及在反應(yīng)過(guò)程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì),。聚苯乙烯等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時(shí)又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來(lái),?？梢哉f(shuō)在ELISA操作中，洗滌是zui主要的關(guān)鍵技術(shù),，應(yīng)引起操作者的高度重視,，操作者應(yīng)嚴(yán)格按要求洗滌，不得馬虎,。
洗滌的方式除某些ELISA儀器配有特殊的自動(dòng)洗滌儀外,，手工操作有浸泡式和流水沖洗式兩種，過(guò)程如下：
（1）浸泡式 a.吸干或甩干孔內(nèi)反應(yīng)液,；b.用洗滌液過(guò)洗一遍（將洗滌液注滿板孔后,，即甩去）；c.浸泡,，即將洗滌液注滿板孔,，放置1-2分鐘，間歇搖動(dòng),，浸泡時(shí)間不可隨意縮短,；d.吸干孔內(nèi)液體,。吸干應(yīng)*，可用水泵或真空泵抽吸,，也可甩去液體后在清潔毛巾或吸水紙上拍干,；e.重復(fù)操作c和d，洗滌3-4次（或按說(shuō)明規(guī)定）,。在間接法中如本底較高,，可增加洗滌次數(shù)或延長(zhǎng)浸泡時(shí)間。
微量滴定板多采用浸泡式洗滌法,。洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液,。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團(tuán),，也含親水基團(tuán),，其疏水基團(tuán)與蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)借疏水鍵結(jié)合，從而削弱蛋白質(zhì)與固相載體的結(jié)合,，并借助于親水基團(tuán)和水分子的結(jié)合作用,，使蛋白質(zhì)回復(fù)到水溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體,。洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20,，其濃度可在0.05%-0.2%之間，高于0.2%時(shí),，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗(yàn)的靈敏度,。
（2）流水沖洗式 流水沖洗法zui初用于小珠載體的洗滌，洗滌液僅為蒸餾水甚至可用自來(lái)水,。洗滌時(shí)附接一特殊裝置,，使小珠在流水沖擊下不斷地滾動(dòng)淋洗，持續(xù)沖洗2分鐘后,，吸干液體,，再用蒸餾水浸泡2分鐘，吸干即可,。浸泡式猶如盆浴,，流水沖洗式則好比淋浴,，其洗滌效果更為*,，且也簡(jiǎn)便、快速,。已有實(shí)驗(yàn)表明,，流水沖洗式同樣也適用于微量滴定板的洗滌。洗滌時(shí)設(shè)法加大水流量或加大水壓,，讓水流沖擊板孔表面,，洗滌效果更佳,。

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