本試劑盒用于體外定量檢測(cè)血清,、血漿,、組織勻漿及相關(guān)液體樣本中人Ⅴ型膠原(COL5)的含量,。

有效期：6個(gè)月

保存條件：2-8℃

人Ⅴ型膠原(COL5)試劑盒組成：

備注：

1.（96T/48T）打開包裝后請(qǐng)及時(shí)檢查所有物品是否齊全,。

2. 標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次為：800,、400、200,、100,、50,、25 pg/mL

3. 經(jīng)過大量正常標(biāo)本檢驗(yàn)，標(biāo)本的正常濃度值均在試劑盒提供的檢測(cè)范圍內(nèi),，實(shí)驗(yàn)過程中直接取50μL樣本上樣即可,。當(dāng)有部分樣本值超過標(biāo)準(zhǔn)品濃度時(shí)，可用樣本稀釋液將標(biāo)本進(jìn)行適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn),。

檢測(cè)前準(zhǔn)備工作：

1.請(qǐng)?zhí)崆?0分鐘從冰箱中取出試劑盒,，平衡至室溫。

2.從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結(jié)晶,，屬于正?，F(xiàn)象；放置室溫,，輕搖均勻,，待結(jié)晶溶解后再配置洗滌液?？蓪?0ml濃縮洗滌液用蒸餾水或去離子水稀釋配置成400ml工作濃度的洗滌液,，未用完的放回4℃

3.20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份20×洗滌緩沖液加19份蒸餾水,。

實(shí)驗(yàn)原理：

試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）,。往預(yù)先包被人Ⅴ型膠原(COL5)捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標(biāo)本,、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體,，經(jīng)過溫育并洗滌,。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成的黃色,。顏色的深淺和樣品中的人Ⅴ型膠原(COL5)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長下測(cè)定吸光度（OD 值）,，計(jì)算樣品濃度,。

實(shí)驗(yàn)所需自備試驗(yàn)器材：

1.酶標(biāo)儀（450nm）

2.高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL,、20-200uL,、200-1000uL

3.37℃恒溫箱

4.蒸餾水或去離子水

人Ⅴ型膠原(COL5)試劑盒樣本處理及要求：

1.血清：將收集于血清分離管的全血標(biāo)本在室溫放置2小時(shí)或4℃過夜，然后1000×g離心20 分鐘,，取上清即可,，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

2.血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標(biāo)本,，并將標(biāo)本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8℃ 1000×g離心15分鐘,，取上清即可檢測(cè)，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

3.組織勻漿：用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細(xì)胞會(huì)影響測(cè)量結(jié)果）,，稱重后將組織剪碎,。將剪碎的組織與對(duì)應(yīng)體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對(duì)應(yīng)9mL的PBS,，具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整,，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中,，于冰上充分研磨,。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞，可以對(duì)勻漿液進(jìn)行超聲破碎,，或反復(fù)凍融,。將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測(cè),。

4.細(xì)胞培養(yǎng)物上清：請(qǐng)1000×g離心20分鐘,，取上清即可檢測(cè)，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

5.其它生物標(biāo)本：1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè),。

6.樣品外觀：樣品應(yīng)清澈透明,，懸浮物應(yīng)離心去除。

7.樣品保存：樣品收集后若在1周內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)的可保存于4℃,，若不能及時(shí)檢測(cè),，請(qǐng)按一次使用量分裝，凍存于-20℃（1個(gè)月內(nèi)檢測(cè)）,，或-80℃（6個(gè)月內(nèi)檢測(cè)）,，避免反復(fù)凍融，標(biāo)本溶血會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果,，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè),。

注意事項(xiàng)：

1.嚴(yán)格按照規(guī)定的時(shí)間和溫度進(jìn)行溫育以保證準(zhǔn)確結(jié)果。所有試劑都必須在使用前達(dá)到室溫20-25℃,。使用后立即冷藏保存試劑,。

2.洗板不正確可以導(dǎo)致不準(zhǔn)確的結(jié)果。在加入底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體,。溫育過程中不要讓微孔干燥掉,。

3.消除板底殘留的液體和手指印,，否則影響OD值。

4.底物顯色液應(yīng)呈無色或很淺的顏色,，已經(jīng)變藍(lán)的底物液不能使用,。

5.避免試劑和標(biāo)本的交叉污染以免造成錯(cuò)誤結(jié)果。

6.在儲(chǔ)存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射,。

7.平衡至室溫后再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上,。

8.任何反應(yīng)試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強(qiáng)烈氣體。任何漂白成分都會(huì)破壞試劑盒中反應(yīng)試劑的生物活性,。

9.不能使用過期產(chǎn)品,。

10.如果可能傳播疾病，所有的樣品都應(yīng)管理好,，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測(cè)裝置,。

操作步驟：

1．從室溫平衡60min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃,。

2．設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔,，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL。

3．樣本孔中a加入待測(cè)樣本50μL,；空白孔不加,。

4．除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗體100μL,，用封板膜封住反應(yīng)孔,，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5．棄去液體,，吸水紙上拍干,，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min,，甩去洗滌液,，吸水紙上拍干,，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機(jī)洗板）,。

6．每孔加入底物A、B各50μL,，37℃避光孵育15min,。

7．每孔加入終止液50μL，15min內(nèi),，在450nm波長處測(cè)定各孔的OD值,。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算：

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：在Excel工作表中，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo),，對(duì)應(yīng)OD值作縱坐標(biāo),，繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線,，按曲線方程計(jì)算各樣本濃度值。

（此圖僅供參考）

人Ⅴ型膠原(COL5)試劑盒性能：

1. 檢測(cè)范圍：25 pg/mL – 800 pg/mL,。

2.靈敏度：檢測(cè)濃度小于1.0 pg/mL,。

3.特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。

4.重復(fù)性：板內(nèi)變異系數(shù)小于10% ,，板間變異系數(shù)小于15% ,。

技術(shù)小提示：

1.當(dāng)混合或重溶蛋白溶液時(shí)，盡量避免起沫,。

2.為了避免交叉感染,，配置不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品、上樣,、加不同試劑都需要更換槍頭,。另外不同試劑請(qǐng)分別使用不同的移液槽。

3.每次孵育時(shí),，請(qǐng)正確使用封板膠可保證結(jié)果的準(zhǔn)確性,。

4.混合后的顯色底物在上板前應(yīng)為無色，請(qǐng)避光保存,；假如微孔板后,，將由物色變成不同深度的藍(lán)色。

5.終止液上板順序應(yīng)同顯色底物上板順序一致,；加入終止液后,，孔內(nèi)顏色由藍(lán)變黃；若孔內(nèi)有綠色,，則表明孔內(nèi)液體未混勻,；請(qǐng)充分混合。

說明：

1.由于現(xiàn)有條件及科學(xué)技術(shù)水平尚不能對(duì)所有供貨商提供的所有原料進(jìn)行全面的鑒定與分析,，本產(chǎn)品可能存在一定的質(zhì)量技術(shù)風(fēng)險(xiǎn),。

2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果與試劑的有效性、實(shí)驗(yàn)者的相關(guān)操作以及當(dāng)時(shí)的實(shí)驗(yàn)環(huán)境密切相關(guān),，請(qǐng)務(wù)必準(zhǔn)備充足的標(biāo)本備份,。

3.不同批次的同一產(chǎn)品可能會(huì)有少許差別，如：檢測(cè)限,、靈敏度以及顯色時(shí)間等,，請(qǐng)依據(jù)試劑盒內(nèi)說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，網(wǎng)站電子版說明書僅作參考,。

4.只有全部使用本試劑盒配套試劑才能保證檢測(cè)效果,，不能混用其他制造商的產(chǎn)品。只有嚴(yán)格遵守本試劑盒的實(shí)驗(yàn)說明才會(huì)得到的檢測(cè)結(jié)果。