本試劑盒用于體外定量檢測血清,、血漿,、組織勻漿及相關(guān)液體樣本中人Ⅰ型膠原C端肽(CTX-Ⅰ)的含量,。

有效期：6個月

保存條件：2-8℃

試劑盒組成：

備注：

1.(96T/48T)打開包裝后請及時檢查所有物品是否齊全,。

2. 標準品濃度依次為：800,、400、200,、100,、50、25 pg/mL

3. 經(jīng)過大量正常標本檢驗,，標本的正常濃度值均在試劑盒提供的檢測范圍內(nèi),，實驗過程中直接取50μL樣本上樣即可。當有部分樣本值超過大標準品濃度時,，可用樣本稀釋液將標本進行適當稀釋后再進行實驗,。

人Ⅰ型膠原C端肽(CTX-Ⅰ)試劑盒檢測前準備工作：

1.請?zhí)崆?0分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫,。

2.從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結(jié)晶,，屬于正常現(xiàn)象；放置室溫,，輕搖均勻,，待結(jié)晶溶解后再配置洗滌液?？蓪?0ml濃縮洗滌液用蒸餾水或去離子水稀釋配置成400ml工作濃度的洗滌液,，未用完的放回4℃

3.20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份20×洗滌緩沖液加19份蒸餾水,。

實驗原理：

試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA),。往預(yù)先包被人Ⅰ型膠原C端肽(CTX-Ⅰ)捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標本,、標準品,、HRP標記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并洗滌,。用底物TMB顯色,，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的,。顏色的深淺和樣品中的人Ⅰ型膠原C端肽(CTX-Ⅰ)呈正相關(guān),。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度(OD 值)，計算樣品濃度,。

實驗所需自備試驗器材：

1.酶標儀(450nm)

2.高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL,、2-20uL、20-200uL,、200-1000uL

3.37℃恒溫箱

4.蒸餾水或去離子水

樣本處理及要求：

1.血清：將收集于血清分離管的全血標本在室溫放置2小時或4℃過夜,，然后1000×g離心20 分鐘，取上清即可,，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

2.血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標本,，并將標本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8℃ 1000×g離心15分鐘,，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

3.組織勻漿：用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液(勻漿中裂解的紅細胞會影響測量結(jié)果),，稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應(yīng)體積的PBS(一般按1:9的重量體積比,，比如1g的組織樣品對應(yīng)9mL的PBS,，具體體積可根據(jù)實驗需要適當調(diào)整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑)加入玻璃勻漿器中,，于冰上充分研磨,。為了進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎,，或反復(fù)凍融,。后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測,。

4.細胞培養(yǎng)物上清：請1000×g離心20分鐘,，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

5.其它生物標本：1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測,。

6.樣品外觀：樣品應(yīng)清澈透明,，懸浮物應(yīng)離心去除。

7.樣品保存：樣品收集后若在1周內(nèi)進行檢測的可保存于4℃,，若不能及時檢測,，請按一次使用量分裝，凍存于-20℃(1個月內(nèi)檢測),，或-80℃(6個月內(nèi)檢測),，避免反復(fù)凍融，標本溶血會影響后檢測結(jié)果,，因此溶血標本不宜進行此項檢測,。

注意事項：

1.嚴格按照規(guī)定的時間和溫度進行溫育以保證準確結(jié)果。所有試劑都必須在使用前達到室溫20-25℃,。使用后立即冷藏保存試劑,。

2.洗板不正確可以導(dǎo)致不準確的結(jié)果。在加入底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體,。溫育過程中不要讓微孔干燥掉,。

3.消除板底殘留的液體和手指印，否則影響OD值,。

4.底物顯色液應(yīng)呈無色或很淺的顏色,，已經(jīng)變藍的底物液不能使用。

5.避免試劑和標本的交叉污染以免造成錯誤結(jié)果,。

6.在儲存和溫育時避免強光直接照射,。

7.平衡至室溫后再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。

8.任何反應(yīng)試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強烈氣體,。任何漂白成分都會破壞試劑盒中反應(yīng)試劑的生物活性,。

9.不能使用過期產(chǎn)品,。

10.如果可能傳播疾病，所有的樣品都應(yīng)管理好,，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置,。

操作步驟：

1．從室溫平衡60min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃,。

2．設(shè)置標準品孔和樣本孔,，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL。

3．樣本孔中a加入待測樣本50μL,；空白孔不加,。

4．除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的檢測抗體100μL,，用封板膜封住反應(yīng)孔,，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5．棄去液體,，吸水紙上拍干,，每孔加滿洗滌液(350μL)，靜置1min,，甩去洗滌液,，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次(也可用洗板機洗板),。

6．每孔加入底物A,、B各50μL，37℃避光孵育15min,。

7．每孔加入終止液50μL,，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值,。

實驗結(jié)果計算：

繪制標準曲線：在Excel工作表中,，以標準品濃度作橫坐標，對應(yīng)OD值作縱坐標,，繪制出標準品線性回歸曲線,，按曲線方程計算各樣本濃度值。

(此圖僅供參考)

性能：

1. 檢測范圍：25 pg/mL – 800 pg/mL,。

2.靈敏度：檢測濃度小于1.0 pg/mL,。

3.特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。

4.重復(fù)性：板內(nèi)變異系數(shù)小于10% ,，板間變異系數(shù)小于15% ,。

技術(shù)小提示：

1.當混合或重溶蛋白溶液時，盡量避免起沫,。

2.為了避免交叉感染,，配置不同濃度標準品,、上樣、加不同試劑都需要更換槍頭,。另外不同試劑請分別使用不同的移液槽。

3.每次孵育時,，請正確使用封板膠可保證結(jié)果的準確性,。

4.混合后的顯色底物在上板前應(yīng)為無色，請避光保存,；假如微孔板后,，將由物色變成不同深度的藍色。

5.終止液上板順序應(yīng)同顯色底物上板順序一致,；加入終止液后,，孔內(nèi)顏色由藍變黃；若孔內(nèi)有綠色,，則表明孔內(nèi)液體未混勻,；請充分混合。

人Ⅰ型膠原C端肽(CTX-Ⅰ)試劑盒說明：

1.由于現(xiàn)有條件及科學(xué)技術(shù)水平尚不能對所有供貨商提供的所有原料進行全面的鑒定與分析,，本產(chǎn)品可能存在一定的質(zhì)量技術(shù)風(fēng)險,。

2.終的實驗結(jié)果與試劑的有效性、實驗者的相關(guān)操作以及當時的實驗環(huán)境密切相關(guān),，請務(wù)必準備充足的標本備份,。

3.不同批次的同一產(chǎn)品可能會有少許差別，如：檢測限,、靈敏度以及顯色時間等,，請依據(jù)試劑盒內(nèi)說明書進行實驗操作，網(wǎng)站電子版說明書僅作參考,。

4.只有全部使用本試劑盒配套試劑才能保證檢測效果,，不能混用其他制造商的產(chǎn)品。只有嚴格遵守本試劑盒的實驗說明才會得到佳的檢測結(jié)果,。