本試劑僅供研究使用     

試驗原理：
caspase-3 試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）.已知caspase-3 濃度的標準品,、未知濃度的樣品加入微孔酶標板內進行檢測,。先將caspase-3 和生物素標記的抗體同時溫育,。洗滌后,，加入親和素標記過的HRP,。再經(jīng)過溫育和洗滌,，去除未結合的酶結合物，然后加入底物A,、B,，和酶結合物同時作用。產生顏色,。顏色的深淺和樣品中caspase-3 的濃度呈比例關系,。

試劑盒內容及其配制 

自備材料

1．蒸餾水。
2．加樣器：5ul,、10ul,、50ul、100ul,、200ul,、500ul、1000ul,。
3．振蕩器及磁力攪拌器等,。

安全性
1．避免直接接觸終止液和底物A、B,。一旦接觸到這些液體,，請盡快用水沖洗。
2．實驗中不要吃喝,、抽煙或使用化妝品,。
3．不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。

操作注意事項
1．試劑應按標簽說明書儲存,，使用前恢復到室溫,。稀稀過后的標準品應丟棄,，不可保存。
2．實驗中不用的板條應立即放回包裝袋中,，密封保存,，以免變質。
3．不用的其它試劑應包裝好或蓋好,。不同批號的試劑不要混用,。保質前使用,。
4．使用一次性的吸頭以免交叉污染,，吸取終止液和底物A、B液時,，避免使用帶金屬部分的加樣器,。
5．使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品,。
6．洗滌酶標板時應充分拍干,，不要將吸水紙直接放入酶標反應孔中吸水。
7．底物A應揮發(fā),，避免長時間打開蓋子,。底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下,。避免用手接觸,，有毒。實驗完成后應立即讀取OD值,。
8．加入試劑的順序應一致,，以保證所有反應板孔溫育的時間一樣。
9．按照說明書中標明的時間,、加液的量及順序進行溫育操作,。

樣品收集、處理及保存方法
1,、血清-----操作過程中避免任何細胞刺激,。使用不含熱原和內毒素的試管。收集血液后,，1000×g離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離,。
2、血漿-----EDTA,、檸檬酸鹽,、肝素血漿可用于檢測。1000×g離心30分鐘去除顆粒,。
3,、細胞上清液---1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物,。
4、組織勻漿-----將組織加入適量生理鹽水搗碎,。1000×g離心10分鐘,，取上清液
5、保存------如果樣品不立即使用,，應將其分成小部分-70 ℃保存,，避免反復冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血,。如果血清中大量顆粒,，檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍,。應在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍,。

試劑的準備
1．標準品：標準品的系列稀釋應在實驗時準備，不能儲存,。稀釋前將標準品振蕩混勻,。稀釋比例按下表中進行：

2．洗滌緩沖液（50×）的稀釋：蒸餾水50倍稀釋。

操作步驟
1．使用前,，將所有試劑充分混勻,。不要使液體產生大量的泡沫，以免加樣時加入大量的氣泡,，產生加樣上的誤差,。
2．根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標準品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個標準品和空白孔建議做復孔,。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定,，能使用復孔的盡量做復孔。標本用標本稀釋液1：1稀釋后加入50ul于反應孔內,。
3．加入稀釋好后的標準品50ul于反應孔,、加入待測樣品50ul于反應孔內。立即加入50ul的生物素標記的抗體,。蓋上膜板,，輕輕振蕩混勻，37℃溫育1小時,。
4．甩去孔內液體,，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒,，甩去洗滌液,，用吸水紙拍干。重復此操作3次,。如果用洗板機洗滌,，洗滌次數(shù)增加一次,。
5．每孔加入60ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻,，37℃溫育30分鐘,。
6．甩去孔內液體，每孔加滿洗滌液,，振蕩30秒,，甩去洗滌液，用吸水紙拍干,。重復此操作3次,。如果用洗板機洗滌，洗滌次數(shù)增加一次,。
7．每孔加入底物A,、B各50ul，輕輕振蕩混勻,，37℃溫育10分鐘。避免光照,。
8．取出酶標板,，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應立即測定結果,。
9．在450nm波長處測定各孔的OD值,。

建議使用的實驗方案

局限
6號標準品以上的結果為非線性的，根據(jù)此標準曲線無法得到的結果,。

試劑盒性能
1. 靈敏度：小的檢測濃度小于1號標準品,。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預期濃度相關系數(shù)R值為0.990,。
2. 特異性：不與其它細胞因子反應,。
3. 重復性：板內、板間變異系數(shù)均小于10%,。

結 果 判 斷 與 分 析
1,、儀器值：于波長450nm的酶標儀上讀取各孔的OD值

2、以吸光度OD值為縱坐標（Y）,，相應的caspase-3 標準品濃度為橫坐標（X）,，做得相應的曲線，樣品的caspase-3 含量可根據(jù)其OD值由標準曲線換算出相應的濃度,。

3,、檢測值范圍：0-40ng/ml

4、敏感度： 0.1 ng/ml