細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法

一,、形態(tài)學(xué)觀察方法

1、HE染色,、光鏡觀察：凋亡細(xì)胞呈圓形,，胞核深染，胞質(zhì)濃縮,，染色質(zhì)成團(tuán)塊狀,，細(xì)胞表面有“出芽”現(xiàn)象。

2,、丫啶橙（AO）染色,，熒光顯微鏡觀察：活細(xì)胞核呈黃綠色熒光，胞質(zhì)呈紅色熒光,。凋亡細(xì)胞核染色質(zhì)呈黃綠色濃聚在核膜內(nèi)側(cè),，可見(jiàn)細(xì)胞膜呈泡狀膨出及凋亡小體,。

3、臺(tái)盼藍(lán)染色：如果細(xì)胞膜不完整,、破裂,，臺(tái)盼藍(lán)染料進(jìn)入細(xì)胞，細(xì)胞變藍(lán),，即為壞死,。如果細(xì)胞膜完整，細(xì)胞不為臺(tái)盼藍(lán)染色,，則為正常細(xì)胞或凋亡細(xì)胞,。此方法對(duì)反映細(xì)胞膜的完整性，區(qū)別壞死細(xì)胞有一定的幫助,。

4,、透射電鏡觀察：可見(jiàn)凋亡細(xì)胞表面微絨毛消失，核染色質(zhì)固縮,、邊集,，常呈新月形，核膜皺褶,，胞質(zhì)緊實(shí),，細(xì)胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小體和凋亡小體被臨近巨噬細(xì)胞吞噬現(xiàn)象,。

二、DNA凝膠電泳

（一）,、檢測(cè)原理

細(xì)胞發(fā)生凋亡或壞死,，其細(xì)胞DNA均發(fā)生斷裂，細(xì)胞內(nèi)小分子量DNA片斷增加,，高分子DNA減少,，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)DNA片斷。但凋亡細(xì)胞DNA斷裂點(diǎn)均有規(guī)律的發(fā)生在核小體之間,，出現(xiàn)180－200bpDNA片斷,，而壞死細(xì)胞的DNA斷裂點(diǎn)為無(wú)特征的雜亂片斷，利用此特征可以確定群體細(xì)胞的死亡,，并可與壞死細(xì)胞區(qū)別,。

（二）結(jié)果判斷

正常活細(xì)胞DNA 電泳出現(xiàn)階梯狀（LADDER）條帶,；壞死細(xì)胞DNA電泳類似血抹片時(shí)的連續(xù)性條帶,。

三、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）核小體測(cè)定

凋亡細(xì)胞的DNA斷裂使細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)核小體,。核小體由組蛋白及其伴隨的DNA片斷組成,，可由ELISA法檢測(cè),。

（一）檢測(cè)步驟

1、將凋亡細(xì)胞裂解后高速離心,，其上清液中含有核小體

2,、在微定量板上吸附組蛋白體

3、加上清夜使抗組蛋白抗體與核小體上的組蛋白結(jié)合

4,、加辣過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗DNA抗體使之與核小體上的DNA結(jié)合

5,、加酶的底物，測(cè)光吸收制,。

（二）用途

該法敏感性高,，可檢測(cè)5*100/ml個(gè)凋亡細(xì)胞?？捎糜谌?、大鼠、小鼠的凋亡檢測(cè),。該法不需要特殊儀器,，適合基層工作，但是不能測(cè)定凋亡細(xì)胞發(fā)生的絕多對(duì)量,。