細胞凋亡的檢測方法

一,、形態(tài)學(xué)觀察方法

1,、HE染色,、光鏡觀察：凋亡細胞呈圓形，胞核深染,，胞質(zhì)濃縮,，染色質(zhì)成團塊狀，細胞表面有“出芽”現(xiàn)象,。

2,、丫啶橙（AO）染色,，熒光顯微鏡觀察：活細胞核呈黃綠色熒光，胞質(zhì)呈紅色熒光,。凋亡細胞核染色質(zhì)呈黃綠色濃聚在核膜內(nèi)側(cè),，可見細胞膜呈泡狀膨出及凋亡小體。

3,、臺盼藍染色：如果細胞膜不完整,、破裂，臺盼藍染料進入細胞,，細胞變藍,，即為壞死。如果細胞膜完整,，細胞不為臺盼藍染色,，則為正常細胞或凋亡細胞。此方法對反映細胞膜的完整性,，區(qū)別壞死細胞有一定的幫助,。

4、透射電鏡觀察：可見凋亡細胞表面微絨毛消失,，核染色質(zhì)固縮,、邊集，常呈新月形,，核膜皺褶,，胞質(zhì)緊實，細胞器集中,，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小體和凋亡小體被臨近巨噬細胞吞噬現(xiàn)象,。

二、DNA凝膠電泳

（一）,、檢測原理

細胞發(fā)生凋亡或壞死,，其細胞DNA均發(fā)生斷裂，細胞內(nèi)小分子量DNA片斷增加,，高分子DNA減少,，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)DNA片斷。但凋亡細胞DNA斷裂點均有規(guī)律的發(fā)生在核小體之間,，出現(xiàn)180－200bpDNA片斷,，而壞死細胞的DNA斷裂點為無特征的雜亂片斷，利用此特征可以確定群體細胞的死亡,，并可與壞死細胞區(qū)別,。

（二）結(jié)果判斷

正常活細胞DNA 電泳出現(xiàn)階梯狀（LADDER）條帶,；壞死細胞DNA電泳類似血抹片時的連續(xù)性條帶,。

三,、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）核小體測定

凋亡細胞的DNA斷裂使細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)核小體。核小體由組蛋白及其伴隨的DNA片斷組成,，可由ELISA法檢測,。

（一）檢測步驟

1、將凋亡細胞裂解后高速離心,，其上清液中含有核小體

2,、在微定量板上吸附組蛋白體

3,、加上清夜使抗組蛋白抗體與核小體上的組蛋白結(jié)合

4,、加辣過氧化物酶標記的抗DNA抗體使之與核小體上的DNA結(jié)合

5、加酶的底物,，測光吸收制,。

（二）用途

該法敏感性高，可檢測5*100/ml個凋亡細胞,?？捎糜谌恕⒋笫?、小鼠的凋亡檢測,。該法不需要特殊儀器，適合基層工作,，但是不能測定凋亡細胞發(fā)生的絕多對量,。